In-Vivo הדמיית סידן של נוירונים חושיים בגנגליון טריגמינלי של חולדה

Somatosensation, הקידוד העצבי של גירויים מכניים, תרמיים וכימיים הפוגעים בעור או במבנים גופניים אחרים, כולל שרירים, עצמות וקרביים, מתחיל בפעילות בתאי עצב ראשוניים המעצבבים מבנים אלה¹. גישות אלקטרופיזיולוגיות מבוססות יחידה אחת סיפקו שפע של מידע על תת-הסוגים המשפיעים המעורבים בתהליך זה, כמו גם כיצד תכונות הגירוי-תגובות שלהם עשויות להשתנות עם הזמן ^1,2,3. עם זאת, בעוד שנותרו ראיות חזקות התומכות בתיאוריית הקו המסומן, אשר מציעה כי שיטות חושיות ספציפיות מועברות על-ידי תת-אוכלוסיות ספציפיות של נוירונים, היכולת של תת-אוכלוסיות רבות של תאי עצב להגיב לאותם סוגים של גירויים מכניים, תרמיים וכימיים מצביעה על כך שרוב הגירויים הסומטוסנסוריים מקודדים על-ידי תת-אוכלוסיות מרובות של תאי עצב^{4, 5}. לכן, הבנה טובה יותר של somatosensation תגיע רק עם היכולת לחקור את הפעילות של 10, אם לא מאות, של נוירונים בו זמנית.

ההתקדמות בגישות אופטיות עם הופעתן לאחרונה יחסית של טכניקות הדמיה קונפוקליות, ולאחר מכן, מולטיפוטונים ודיגיטליים אפשרו את היכולת לבצע ניתוחים לא פולשניים יחסית ברמת האוכלוסייה של פעילות עצבית ^6,7. אחד המכשולים האחרונים ביישום טכנולוגיה זו היה פיתוח כלים המאפשרים הערכה אופטית של פעילות עצבית. בהתחשב במהירות של פוטנציאל פעולה שיכול להתחיל ולהסתיים בפחות מאלפית השנייה, צבע רגיש למתח עם היכולת לעקוב אחר שינויים בפוטנציאל הממברנה במהירות של פוטנציאל פעולה יהיה הכלי האידיאלי למטרה זו. אולם בעוד שחלה התקדמות עצומה בתחום זה 7,8,9,10, יחס האות לרעש עבור רבים מהצבעים האלה עדיין אינו גבוה מספיק כדי לאפשר ניתוח אוכלוסייה של מאות תאי עצב ברמת התא הבודד. כגישה חלופית, החוקרים פנו לניטור שינויים בריכוז Ca²⁺ תוך תאי ([Ca²⁺]_i). המגבלות באסטרטגיה זו היו ברורות מלכתחילה וכוללות את העובדה שעלייה ב-[Ca²⁺]_i היא מדד עקיף לפעילות עצבית¹¹; שעלייה ב-[Ca²⁺]_i עשויה להתרחש ללא תלות בזרם Ca²⁺ הקשור להפעלת ערוצי Ca²⁺ מגודרים במתח (VGCCs)^12,13; שהגודל ומשך הזמן של ארעי Ca²⁺ ניתנים לשליטה על ידי תהליכים שאינם תלויים בפעילות VGCC 11,12,14; וכי מהלך הזמן של Ca²⁺ transients עולה בהרבה על זה של פוטנציאל פעולה¹⁵. עם זאת, ישנם מספר יתרונות משמעותיים הקשורים לשימוש Ca²⁺ כמדד עקיף של פעילות עצבית. לא פחות מהם הוא יחס האות לרעש הקשור לרוב מחווני Ca²⁺, המשקף הן את גודל השינוי ב- Ca²⁺ תוך תאי והן את העובדה שהאות נובע מהמרחב התלת-ממדי של הציטוזול ולא מהמרחב הדו-ממדי של קרום התא. יתר על כן, עם הפיתוח של אינדיקטורים Ca²⁺ מקודדים גנטית (GECI’s), ניתן לנצל אסטרטגיות גנטיות כדי להניע את הביטוי של אינדיקטורים Ca²⁺ בתת-אוכלוסיות ספציפיות של תאים, להקל על ניתוח ברמת האוכלוסייה בהכנות שלמות (למשל, ראה¹⁶).

בהתחשב במספר הכלים הגנטיים הזמינים כיום בעכברים, אין זה מפתיע ש- GECI נמצא בשימוש נרחב ביותר במין זה. קווי עכבר עם ביטוי GECI מכונן בתת-אוכלוסיות של נוירונים חושיים פותחו ^7,16,17. עם התפתחות קווי עכבר המבטאים רקומבינאזות בסוגי תאים ספציפיים, ניתן להשתמש באסטרטגיות מתוחכמות עוד יותר כדי לשלוט בביטוי GECI¹⁵. עם זאת, בעוד שהכלים האלה חזקים יותר מאי פעם, ישנן מספר סיבות לכך שמינים אחרים, כמו חולדות, עשויים להתאים יותר לשאלות ניסוייות מסוימות. אלה כוללים את הגודל הגדול יותר, המאפשר מספר מניפולציות ניסיוניות שקשות, אם לא בלתי אפשריות, בעכבר הקטן יותר; קלות אילוף חולדות במשימות התנהגותיות מורכבות יחסית; ולפחות כמה ראיות לכך שתכונות ביופיזיות ודפוסי ביטוי של כמה תעלות יונים בנוירונים חושיים של חולדות עשויים להיות דומים יותר לאלה שנצפו בנוירונים חושיים אנושיים מאשר אותם ערוצים בעכבר ביחס לבני אדם¹⁸.

בעוד שהטרנסדוקציה של גירויים סומטוסנסוריים מתרחשת בדרך כלל במסופים ההיקפיים של האפרנטים הראשוניים, פוטנציאל הפעולה המתחיל בפריפריה חייב לעבור דרך המבנה המאכלס סומאטה אפרנטית ראשונית, המכונה גרעיני שורש גבי (DRG) או טריגמינל (TG) לפני שהוא מגיע למערכת העצבים המרכזית¹⁹. בעוד שישנן ראיות לכך שלא כל פוטנציאל פעולה המתפשט לאורך אקסון אפירנט ראשוני יפלוש לגוף התא²⁰, תוצאה של העובדה שהסומטה האפרנטית הראשונית מחוברת לאקסון האמפרנט הראשי דרך צומת T¹⁹, נראה שרוב פוטנציאלי הפעולה המופעלים בפריפריה פולשים לסומה²¹. זה מעניק שלושה יתרונות ניסיוניים בעת שימוש ב- GECIs כדי להעריך קידוד אוכלוסייה ב- afferents ראשוניים: הגודל הגדול של גוף התא ביחס לאקסונים מגדיל עוד יותר את האות לרעש בעת שימוש ב- [Ca²⁺]_i כמדד עקיף לפעילות afferent; DRG הם בדרך כלל קל לגישה; והערכת הפעילות באתר המרוחק מרחבית מהטרמינלים האפרנטיים ממזערת את ההשפעה הפוטנציאלית של הניתוח הדרוש לחשיפת הגרעינים על תכונות הגירוי-תגובה של הטרמינלים האפרנטיים. עם זאת, מאחר שTG ממוקמים מתחת למוח (או מעל לוח הצבעים), הם הרבה יותר קשים לגישה מאשר DRG. יתר על כן, בעוד שיש קווי דמיון רבים בין נוירונים DRG ונוירונים TG, יש רשימה הולכת וגדלה של הבדלים גם כן. זה כולל את הארגון הסומטוטופי בערך של תאי עצב ב- TG²², מבנים ייחודיים עצביים, דפוסי סיום מסוף מרכזי שונים 23,24,25,26, וכעת רשימה הולכת וגדלה של הבדלים הן בביטוי גנים ^27,28 והן בביטוי קולטן פונקציונלי²⁹. בנוסף, מכיוון שאנו מתעניינים בזיהוי מנגנונים היקפיים של כאב, המספר הגדול יחסית של תסמונות כאב שנראות ייחודיות למערכת הטריגמינלית (למשל, מיגרנה, נוירלגיה טריגמינלית, תסמונת הפה השורף) שנראות כמערבות פעילות חריגה בגורמים ראשוניים 30,31,32, מצביע על כך שיש לחקור את TG ישירות.

לכן, בעוד תכונות גירוי-תגובה של נוירונים TG נחקרו עם GECIs בעכבר¹⁶, מאחר שהסיבות המפורטות לעיל מצביעות על כך שהחולדה עשויה להיות מין מתאים יותר לענות על מגוון שאלות ניסוייות, מטרת המחקר הנוכחי הייתה לפתח גישה לשימוש ב-GECIs לחקר נוירוני TG בחולדה. כדי להשיג זאת, השתמשנו בגישה ויראלית כדי להניע את הביטוי של GECI GCaMP6s במערכת העצבים ההיקפית. לאחר מכן הסרנו את המוח הקדמי כדי לאפשר גישה ל-TG. לבסוף, גירויים מכניים ותרמיים הוחלו על הפנים בעוד תגובות עצביות הוערכו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. יחד, נתונים אלה תומכים בתפקיד של ניצול החולדה לחקר שינויים בTG במצבים רבים, ומרחיבים את ארגז הכלים לחוקרים המעוניינים בקידוד חושי במערכת הטריגמינלית.