Pulizia ottica ed etichettatura per la microscopia a fluorescenza a foglio luminoso nell'imaging cerebrale umano su larga scala

L’analisi dell’organizzazione molecolare 3D e della citoarchitettura di grandi volumi del cervello umano richiede la trasparenza ottica dei campioni, ottenuta attraverso protocolli con tempi di elaborazione estesi. Le tecniche di compensazione ottica sono state sviluppate per ridurre al minimo l’eterogeneità dell’indice di rifrazione (RI) all’interno dei tessuti, riducendo così la dispersione della luce e aumentando la profondità di penetrazione della luce per l’imaging ad alta risoluzione 1,2,3,4,5. Gli attuali progressi nei metodi di clearing e marcatura dei tessuti profondi consentono l’imaging volumetrico di organi ed embrioni di roditori intatti sfruttando tecniche di microscopia all’avanguardia 6,7,8,9,10,11,12.

Tuttavia, la ricostruzione volumetrica 3D di vaste aree del cervello umano post-mortem rappresenta ancora un compito impegnativo rispetto agli organismi modello. La complessa composizione biologica e le variabili condizioni di fissazione e conservazione post-mortem possono compromettere l’efficienza di eliminazione dei tessuti, la profondità di penetrazione degli anticorpi e il riconoscimento dell’epitopo 13,14,15,16,17,18,19. Inoltre, il sezionamento meccanico dei tessuti e la successiva pulizia ed etichettatura di ogni fetta sono ancora necessari per ottenere una pulizia efficiente e un’etichettatura uniforme di grandi aree cerebrali umane, con conseguenti lunghi tempi di lavorazione e la necessità di sofisticate apparecchiature personalizzate, rispetto agli organismi modello 15,20,21,22.

La tecnica di trasformazione tissutale SWITCH – H₂O₂ – antigen Retrieval –TDE (SHORT) è stata sviluppata specificamente per analizzare grandi volumi del cervello umano^18,23. Questo metodo impiega la conservazione strutturale dei tessuti del protocollo SWITCH¹¹ e alte concentrazioni di perossido di idrogeno per ridurre l’autofluorescenza tissutale, in combinazione con il ripristino dell’epitopo. SHORT consente una colorazione uniforme di fette di cervello umano con marcatori per diversi sottotipi neuronali, cellule gliali, vascolarizzazione e fibre mieliniche^18,24. I suoi risultati sono compatibili con l’analisi di proteine sia a bassa che ad alta densità. Gli elevati livelli di trasparenza che ne derivano e l’etichettatura uniforme consentono la ricostruzione volumetrica di fette spesse con microscopia a fluorescenza, in particolare, per l’acquisizione rapida è possibile utilizzare apparecchi a foglio di luce 18,24,25,26,27.

In questo lavoro, descriviamo come la tecnica di trasformazione tissutale SHORT può essere utilizzata per la pulizia simultanea e l’etichettatura multi-round di decine di sezioni di cervello umano fissate in formalina. Quattro diversi marcatori fluorescenti possono essere utilizzati insieme, portando all’identificazione di diverse sottopopolazioni cellulari. Dopo la pulizia, è possibile eseguire l’imaging volumetrico ad alta risoluzione con microscopia a fluorescenza. In questo caso, abbiamo utilizzato un LSFM invertito su misura 18,24,25,26,27, che consente un rapido sezionamento ottico del campione e una rapida acquisizione di più canali in parallelo. Con questo protocollo di routine ad alto rendimento, è possibile ottenere una caratterizzazione cellulare e strutturale completa con una risoluzione sub-cellulare di vaste aree del cervello umano, come già dimostrato nella mappatura di un’intera area di Broca²³.