追踪果蝇中糖诱导的局部搜索行为

本研究采用 果蝇黑腹果蝇Canton-S （CS）野生型果蝇的成年雄性果蝇。 1.实验准备 苍蝇饲养收集在12小时内出现的成年雄性果蝇，并在12小时的光/暗循环中将它们保持在标准苍蝇培养基（内部制备）上48小时，相对湿度为75%。注：使用的 果蝇 培养基组合物是（对于1L培养基）玉米粉（80g），D-葡萄糖（20g），糖（40g），琼脂（8g），酵母粉（15g），丙酸（4mL），4-羟基苯甲酸甲酯（3mL乙醇中的1.25g）和正磷酸（600μL）（参见 材料表）。最初的喂养期确保苍蝇在饥饿阶段之前获得足够的食物和营养。虽然雄性和雌性苍蝇都会引起搜索行为，但雄性苍蝇的饥饿时间更一致。此外，雌性苍蝇在交配后会改变它们的摄食偏好11. 饥饿程序喂食期过后，让苍蝇挨饿，但要喝水。注意：为了标准化试验和菌株之间的饥饿状态，建议确定人口在食物匮乏条件下 90% 的存活时间。基于这一结果， CS 苍蝇挨饿28小时（图1A），因为昼夜节律和其他因素会影响搜索行为12。还测量了一天中不同时间苍蝇搜索活动的昼夜节律变化（图1B）。我们注意到，与苍蝇的光相相比，夜间的相对搜索活动有所减少。 通过剥夺两天大的苍蝇的食物来计算食物饥饿耐受性。将 15-20 只苍蝇放入底部浸湿薄纸的小瓶中。这可作为基质，确保苍蝇在整个饥饿期间都能获得水。 以1小时的固定间隔计算食物饥饿期间的苍蝇数量。90%的饥饿苍蝇存活的持续时间被用作饥饿期（图1A）。使用多次重复（每个菌株 3-4 次）以尽量减少个体变异的影响，并提供更可靠的饥饿耐受性评估。注意：确定每种菌株的食物饥饿耐受性，以便在不同菌株和实验之间建立标准化的饥饿状态。通过以这些时间间隔计算幸存的苍蝇，人们可以监测一段时间内的存活率，并确定每种菌株在屈服于饥饿之前可以忍受食物剥夺多长时间。 记录行为的过程将单个饥饿的苍蝇转移到小管中（图2A）。以 5-6 只苍蝇为一组进行此操作，以最大程度地减少隔离时间。通过测试单只苍蝇，隔离每只苍蝇，任何观察到的变化或动作都可以归因于观察到的特定苍蝇，而不是受到与其他苍蝇相互作用的影响。 使用 90 mm 培养皿作为行为测定的舞台（可以使用更大的培养皿。在直径较大的培养皿中，行为没有差异）。通过表面安装的冷白光 LED 面板从底部照亮竞技场（图 2B、C）。为了保持均匀的视觉环境并尽量减少外部干扰，请用白色聚氯乙烯管（高 51.5 毫米，内径 114 毫米）包围实验场。注意：这根管子起到屏障的作用，防止来自竞技场外的任何视觉刺激影响苍蝇的行为。通过减少外部干扰，人们可以只关注果蝇与食物来源的相互作用，在整个实验过程中保持一致性。 在竞技场中心使用 320 勒克斯的光强度。 将 0.2 μL 糖溶液放置在竞技场中央。在报告的实验中使用了500mM蔗糖溶液，但这可以有所不同。使用 2 mL 微型离心管（内径 8.7 mm，通过在底部填充棉花将长度减少到 5 mm）将苍蝇引入竞技场; 图2A）容纳一只倒置在糖滴上的苍蝇。 一旦苍蝇开始摄入飞沫，取出苍蝇容器，让苍蝇不受限制地接触食物来源。 用高架摄像机拍摄竞技场的 2D 位置。注：本研究使用Flea3（Point Grey，1214 mm镜头，见 材料表），并以每秒40帧（fps）记录。但是，可以使用任何与背景形成良好对比度的相机。可以以 30-60 fps 的速度录制，具体取决于实验的性质。以.avi格式记录，因为它与跟踪软件兼容。 记录审判，直到苍蝇逃离竞技场。苍蝇可以自由行走，竞技场上没有盖子。 通过让苍蝇决定何时停止搜索、飞走或走到竞技场的外围，观察苍蝇的自然行为和食物搜索策略。在试验之间用70%乙醇擦拭培养皿并完全干燥，否则使用新的培养皿。注意：当苍蝇表现出持续的高活动水平时，在灯亮后 2 小时到 6 小时之间进行所有实验很重要。这个时间范围确保苍蝇处于活跃状态，最大限度地观察其自然食物搜索行为的机会，并减少可能影响其行为的其他因素的影响，例如昼夜节律。行为设置被安置在一个温度和湿度控制的房间内。竞技场被放置在一个无振动的桌子上。该实验设置涉及分离和测试个体果蝇对糖的反应。向饥饿的苍蝇提供糖滴，并记录它们的行为（图2B，C，视频1）。实验是在特定时间范围内进行的，当时果蝇表现出一致的高活动水平。 分析步骤 2 之后的轨迹以确定搜索行为。 2. 本地搜索轨迹分析 使用 Ctrax 软件11 分析录制的视频（参见 材料表）。注意：该软件跟踪苍蝇在视频中的位置并将其转换为 x、y 坐标，从而可以精确跟踪和分析其运动。有关如何使用 Ctrax 的详细信息，请参阅 补充文件 1 。 将轨迹分为两个阶段：初始进料阶段和搜索阶段。将进食的结束和行走的开始定义为苍蝇在三个连续帧中以 >4 mm s-1 的速度移动。注意：喂食结束后，轨迹的其余部分被用作苍蝇的搜索响应。本研究使用VirtualDub（见 材料表）在跟踪之前从视频中去除喂食阶段。 通过以下参数量化搜索：路径长度：此参数表示苍蝇在食物搜索过程中从起点走过的距离（以毫米为单位）。 停留时间：苍蝇在搜索过程中行走所花费的时间（以 s 为单位）。它表示搜索的持续时间和苍蝇寻找食物的持久性。 蜿蜒曲折：通过将路径的直线（路径的第一点和最后一点之间的距离）除以总路径长度，然后从 1 中减去，将其计算为比率。蜿蜒曲折的高值表示轨迹的曲折程度更高。 返回次数：使用开发的算法，使用两个同心圆来识别和计算返回次数。注意：内圈表示搜索的原点，Rin （2.5 mm），外圈表示苍蝇必须远离原点的最小距离 Rout （4 mm）。返回被定义为从外圈（Rout）向外移动，然后回到内圈（Rin）。 活动率：以百分比表示，通过确定苍蝇行走速度超过 2 mm/s 时的食物搜索时间来计算活动率。该参数反映了苍蝇在食物搜索中的活动水平和参与度。它将活跃的觅食者与不太活跃的个体区分开来。注：本研究使用MATLAB和Python进一步分析轨迹。可以在此处访问脚本：https://github.com/eagermeagre/sugar_elicited_search。分析过程涉及使用 Ctrax 软件跟踪苍蝇的运动并确定诸如食物搜索持续时间、总路径长度、搜索时间、蜿蜒曲折、返回次数和活动率等参数。这些参数为在记录的食物搜索实验中苍蝇的行为和觅食效率提供了宝贵的见解。