Burada, sineklerin larvalarında ve dişilerinde besin kaynağı ve yumurtlama tercihlerini değerlendirmek için iki protokol detaylandırılmıştır. Bunlar, birbiriyle etkileşen iki faktöre sahip dört seçenekten oluşur: substrat tipi ve sıcaklık. Tahliller, larvaların besin kaynağı tercihinin ve dişiler için yumurtlama yeri tercihinin belirlenmesini sağlar.
Sinekler (Diptera: Calliphoridae), tipik olarak zorunlu parazitizm, fakültatif parazitizm ve tam sapro-nekrofaji olarak sınıflandırılan çok çeşitli larva yaşam tarzları sunar. Hem zorunlu hem de fakültatif olan birkaç parazitik türün, larvaları miyazise (canlı dokuda kurtçuk istilası) neden olabileceğinden, sıhhi ve ekonomik öneme sahip olduğu düşünülmektedir. Bununla birlikte, yetişkin dişinin yumurtlama bölgesini seçerken belirleyici bir rol oynaması ve bu nedenle larvaların beslenme alışkanlığını ve gelişim koşullarını büyük ölçüde belirlemesi dikkat çekicidir. Bu çalışmada, larva beslenme tercihini ve dişi yumurtlama bölgesi tercihini test etmek için iki etkileşimli faktör göz önünde bulundurularak iki protokol önerilmiştir: et substrat tipi ve sıcaklığı. Burada sunulan kurulumlar, Lucilia cuprina larvalarının ve gravid dişilerinin iki sıcaklık (33 ± 2 °C ve 25 ± 2 °C) ve iki tür et substratı (kanla takviye edilmiş taze et ve 5 günlük çürük et) ile dört seçenekli bir tahlilde test edilmesine izin verdi. Larvalar veya gravid dişiler, yumurtalarını sırasıyla aşağıdakilerden birine yerleştirmeyi veya bırakmayı seçebilirler: 25 °C’de çürük et (nekrofag bir tür durumunu simüle eder), 33 °C’de kanla takviye edilmiş taze et (parazitik bir tür durumunu simüle eder) ve iki kontrol, 33 °C’de çürük et veya 25 °C’de kanla desteklenmiş taze et. Tercih, her bir kopya için her seçeneğe bırakılan larva veya yumurta sayısı sayılarak değerlendirilir. Gözlemlenen sonuçların rastgele bir dağılımla karşılaştırılması, tercihin istatistiksel anlamlılığının tahmin edilmesine izin verdi. Sonuçlar, L. cuprina larvalarının 25 °C’de çürümüş substrat için güçlü bir tercihe sahip olduğunu göstermiştir. Tersine, dişilerin yumurtlama bölgesi tercihi et türü için daha çeşitliydi. Bu metodoloji, benzer büyüklükteki diğer böcek türlerinin tercihini test etmek için uyarlanabilir. Diğer sorular da alternatif koşullar kullanılarak araştırılabilir.
Sinekler, özellikle kaliptrat muskoidleri (diğerlerinin yanı sıra sinekler, karasinekler, bot sinekleri ve et sinekleri dahil), parazitik ve nekro-saprofag davranışları kapsayan çok çeşitli yaşam tarzları sergilerler1. Parazitik türler tipik olarak kurtçuklar (larvalar) tarafından canlı dokuların istilası olan miyazise neden olur2. Calliphoridae familyasında, hem zorunlu hem de fakültatif parazitik türler, kurtçuk istilasınedeniyle ekonomik kayıplardan ve zayıf hayvan refahından sorumlu başlıca hayvan zararlılarıdır 2,3,4,5,6,7. Yeni Dünya ve Eski Dünya vidalı kurtları (sırasıyla Cochliomyia hominivorax ve Chrysomyia bezziana) gibi zorunlu parazitler, koyun sinekleri (Lucilia cuprina ve Lucilia sericata) gibi fakültatif parazitlerle birlikte özellikle sorunludur 4,7,8,9,102,5,6, 7. Sapro-nekrofag olanlar da dahil olmak üzere parazitik olmayan türler, çürüyen ve nekrotik organik maddelerde gelişir ve genellikle sağlıksız ortamlarda bulunur. Kesinlikle parazitik olmayan yaşam tarzları, nekrotik dokuların yaralarını temizlemek için sinek larvalarını kullanan kurtçuk tedavisi için başarıyla kullanılabilir11,12,13. Sinekler, yakın zamanda ölen cesetleri bulan ve kolonize eden ilk organizmalar arasında oldukları için adli bilimlerde de kullanılır ve gelişmekte olan larvalar ölüm zamanını tahmin etmenin bir aracı olarak hizmet eder14.
Sinek yaşam tarzları, insan çıkarları ile ilgili önemleri nedeniyle çeşitli araştırma çalışmalarına (örneğin, 15,16,17,18,19,20,21) konu olmuştur. Bir türün yaşam tarzını yöneten biyolojik mekanizmaları anlamak, haşere türlerini kontrol etmeyi amaçlayan yöntemlerin iyileştirilmesine ilişkin değerli bilgiler sağlayabilir. Ayrıca, sinek yaşam tarzlarının çeşitliliği ve evrimi, karmaşık özelliklerin (örneğin, parazitizm) kökenlerini ve mekanizmalarını incelemek için ideal bir bağlam sunar. Canlı dokuyla beslenen kurtçuklara bağlı parazitizm, Calliphoridae familyası22,23 içinde birkaç kez bağımsız olarak gelişmiştir. Bununla birlikte, sineklerin beslenme alışkanlıklarının evrimsel tarihi hala büyük ölçüde bilinmemektedir ve çalışmalar, fonksiyonel tahlillerin yardımı olmadan filogeniler boyunca alışkanlıkların haritalandırılmasıyla sınırlıdır (örneğin, 16,19,22). Örneğin, zorunlu parazitlerin genelcilerden (yani fakültatif parazitlerden) mi yoksa doğrudan nekrofag türlerden mi evrimleştiği belirsizdir. Yaşam tarzındaki evrimsel değişimlere eşlik eden moleküler, fizyolojik ve davranışsal süreçler de büyük ölçüde bilinmemektedir.
Bu bağlamda, koyun sineği Lucilia cuprina gibi bir konakçıda parazit olarak veya kadavralarda nekrofaj olarak gelişebilen fakültatif parazitler, yaşam tarzı seçimlerini kontrol eden faktörleri ve mekanizmaları keşfetme imkanı sunar. Lucilia cuprina, özellikle zararlı olarak kabul edildiği Avustralya’da koyun sineği çarpmasına neden olduğu bilinen kozmopolit bir türdür 3,16. L. cuprina’ya bağlı miyazis, diğer çiftlik hayvanlarında, evcil hayvanlarda ve insanlarda da ortaya çıkabilir 3,24,25,26,27,28,29,30. Bununla birlikte, larvaları nekrotik dokularda ve çürüyen maddelerde de gelişebilir ve bu tür, cesetleri bulmak ve kolonize etmek çok hızlı olduğu için adli entomolojide başarıyla kullanılmıştır31,32,33,34. Sineklerin parazitik ve parazitik olmayan yaşam tarzı larva evresi ile tanımlansa da, yumurtlama bölgesini seçen yetişkin dişidir. Sonuç olarak, yetişkin dişi, larvaların yaşam tarzını büyük ölçüde etkiler, çünkü ikincisi sınırlı hareket kabiliyetine sahiptir. Bununla birlikte, dişinin seçimi, larvaların bir seçenek sunulduğunda aynı substratı tercih edeceği anlamına gelmez35. Bir hipotez, dişilerin yumurtalarını canlı dokuya bırakmasına yol açan davranış değişikliklerinin, parazitik bir yaşam tarzına erken geçişin bir parçası olabileceğidir. Ortaya çıkan larvaların ön adaptasyonları veya fizyolojik yetenekleri, canlı doku üzerinde başarılı bir şekilde gelişmeleri için gerekli olacak ve parazitik yaşam tarzının ortaya çıkmasına yol açacaktır. Bu nedenle, etkilenen ve seçilen süreçler her iki yaşam evresi arasında mutlaka uyumlu olmayabilir.
Bu bağlamda, sineklerde davranışsal tercihi test etmek için, özellikle L. cuprina için, larva besleme substratı (larva tercih testi) ve yumurtlama bölgesi (dişi tercih testi) ile ilgili iki yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntemler birbiriyle etkileşim halinde olan iki faktörü dikkate alır: sıcaklık ve et tazeliği. Çoğu miyazis vakası homeotermik hayvanlarda meydana geldiğinden sıcaklık çok önemli bir faktör olarak seçilmiştir2. Bu nedenle, 33 °C’lik bir sıcaklık “parazitik yaşam tarzı faktörü” için bir vekil olarak seçilirken, 25 °C’lik bir sıcaklık (oda sıcaklığı) “parazitik olmayan faktörü” temsil eder. Brezilya’da kaydedilen ortalama yıllık sıcaklığı temsil ettiği için 25 °C’lik bir sıcaklık seçilmiştir (Ulusal Meteoroloji Enstitüsü, INMET). Ek olarak, her ikisi de sığır kaynaklarından olmak üzere iki tür et substratı düşünülmüştür: (i) parazitik sinek Co. hominivorax’ı laboratuvar koşullarında yetiştirmek için kullanılan parazitik yaşam tarzı için substratı taklit eden kanla takviye edilmiş taze et36 ve (ii) nekrofag yaşam tarzı için substratı taklit eden 5 günlük çürük et. Sığır substratı, ekolojik olarak haklı bir substrat olmanın yanı sıra kullanılabilirlik, maliyet etkinliği ve pratiklik açısından çeşitli avantajlar sunduğundan, laboratuvar koşullarında 27,37,38,39 L. cuprina’yı yetiştirmek için yaygın olarak kullanılır. Diğer çalışmalar40,41 sineklerde çürük ve taze substratların etkisini karşılaştıran 7 günlük çürük substrat (anaerobik koşullarda) kullanmış ve çürük substratın gelişim oranları, hayatta kalma ve büyüme üzerinde olumsuz bir etkisi olduğunu göstermiştir. L. cuprina’nın genellikle havaya maruz kalan taze kadavraları kolonize ettiği bilindiğinden, nekrofag bir substratı taklit etmek için hermetik olmayan kaplarda (aerobik ve anaerobik ayrışma) 5 günlük çürük et (kıyma) kullanmaya karar verdik.
Burada sunulan deneysel tasarımlar, bireysel faktörlerin yanı sıra bunların birleşik etkileri için tercihleri ayırt etme avantajını sunar. Ayrıca, puanlanan fenotipler, yani larva besleme substratının seçimi ve bırakılan yumurta sayısı, sinek türlerinin biyolojik ve ekolojik yönleriyle doğrudan ilgilidir. Bu protokollerin uygunluğu, L. cuprina’daki etkinlikleri gösterilerek vurgulanmaktadır. Ek olarak, L. cuprina’da elde edilen gözlemlenen sonuçları simüle edilmiş rastgele verilerle karşılaştırmak için kullanılabilecek ve sağlam istatistiksel analiz ve yorumlar sağlayan bir istatistiksel analiz komut dosyası sağlanmıştır.
Özellikle sineklerde parazitlik bağlamında beslenme alışkanlıklarının evrimini anlamak, beslenme veya yumurtlama için farklı yaşam evreleri boyunca substrat tercihlerinin incelenmesini gerektirir. Bu nedenle, bu çalışmada, sineklerin larvalarında ve dişilerinde substrat tercihlerini araştırmak için sağlam ve basit yöntemler önerilmiştir. Bu yöntemler, fakültatif bir parazitik sinek olan Lucilia cuprina’da test edildi2. İlginç bir şekilde, deneyler, tipik olarak…
The authors have nothing to disclose.
Patrícia J. Thyssen, Gabriela S. Zampim ve Lucas de Almeida Carvalho’ya L. cuprina kolonisini sağladıkları ve deneyin kurulmasındaki yardımları için teşekkür ederiz. Videoyu çektiği ve kurguladığı için Rafael Barros de Oliveira’ya da teşekkür ederiz. Bu araştırma, Hayvan Davranışı Derneği’nden V.A.S.C.’ye Gelişmekte Olan Ülke Araştırma Bursu ve TTT’ye FAPESP Dimensions US-Biota-São Paulo hibesi ile desteklenmiştir (20/05636-4). S.T. ve D.L.F. bir FAPESP (sırasıyla 19/07285-7 doktora sonrası hibe ve 21/10022-8 doktora bursu) ile desteklenmiştir. V.A.S.C. ve A.V.R. CNPq doktora bursları ile desteklenmiştir (sırasıyla 141391/2019-7, 140056/2019-0). T.T.T. CNPq (310906/2022-9) tarafından desteklenmiştir.
Agar | Sigma-Aldrich | 05038-500G | For microbiology |
Black cardboards | – | – | 70×50 cm |
Bovine blood with anticoagulat | – | – | 50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water |
Bovine ground Meat | – | – | Around 7-8% of fat |
Brush | – | – | Made with plastic |
Conical tube | Falcon or Generic | – | 50 mL |
Cross-shaped glass containers | Handmade | NA | 48×48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width |
Erlenmeyer | Vidrolabor | NA | 500 mL |
70% Ethanol | Synth | A1084.01.BL | 70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water |
Graduated cylinder | Nalgon or Generic | – | 500 mL and 50 mL |
Heating pad | Thermolux | – | 30×40 cm dimensions, 40 W, 127 V |
Infrared thermometer | HeTaiDa | HTD8808 | Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S, Accuracy: ±0.2 °C, Measuring: 5-15 cm) |
Petri dish (Glass) | Precision | NA | 150×20 mm dimensions |
(Note: the petri dishes can be plastic if used only once) | |||
Petri dish PS | Cralplast | 18130 | 60×15 mm dimensions |
Plastic Pasteur pipette | – | – | 3 mL (total volume) |
Sodium citrate | Synth | C11033.01.AG | 3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water) |
Spoons | – | – | More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel. |
Stainless steel spatula | Generic | – | Flat end and spoon end |
Stereomicroscope | Bioptika | – | WF10X/22 lenses |
Tweezer | – | – | Metal made and fine point |
White led light strips | NA | NA | 4.8 W, 2×0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white) |