Applicazione dello pseudovirus Ha-CoV-2 per la quantificazione rapida delle varianti di SARS-CoV-2 e degli anticorpi neutralizzanti

1. Assemblaggio di virus e particelle virali Vettori: acquista commercialmente vettori di espressione per SARS-CoV-2 M, E o N, nonché SARS-CoV-2 S (Wild-type, Wt), Delta (B.1.617.2) e Omicron (B.1.1.529).NOTA: Le sequenze proteiche dei vettori di espressione sono fornite nel file supplementare 1. Il fornitore di questi vettori di espressione può essere trovato anche nella Tabella dei materiali. Cellule e colture cellulari: mantenere HEK293T cellule nel terreno di Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco contenente il 10% di siero fetale bovino inattivato dal calore (FBS), 50 unità/mL di penicillina e 50 μg/mL di streptomicina.NOTA: Tutto il lavoro di coltura cellulare deve essere eseguito in una cabina di biosicurezza a flusso d’aria laminare. La trasfezione della polietilenimmina (PEI) richiede tipicamente un’incubazione di 5-6 ore. Gli orari di inizio devono essere considerati attentamente in anticipo. Assemblaggio di virus e cotrasfezione basata su PEI: assemblare particelle di Ha-CoV-2 mediante cotrasfezione di cellule HEK293T. Cellule seme in una capsula di Petri per coltura cellulare da 10 cm (4-5 x 10,6 cellule per capsula) in 10 mL di terreno DMEM completo il giorno prima della cotrasfezione. Per questo studio, tre piastre di Petri vengono utilizzate per seminare cellule per l’assemblaggio di Ha-CoV-2 wild-type, Delta e Omicron, rispettivamente. Incubare le piastre di Petri per una notte in un incubatore di CO2 a 37 °C. Controllare i piatti la mattina successiva per assicurarsi che le cellule siano confluenti all’80%. Rimuovere il terreno completo e sostituirlo con 9 mL di terreno privo di siero DMEM. Per ogni piatto, preparare una miscela di cotrasfezione con 2,5 μg di ciascuno dei vettori di espressione proteica strutturale SARS-CoV-2 (N, E, M), 10 μg di pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (genoma HaCoV2) e 2,5 μg del vettore di espressione della proteina S, delle varianti Delta o Omicron S e 45 μL di reagente di trasfezione a base di PEI. Lasciare che la miscela di cotrasfezione formi complessi incubando per 13 minuti (non incubare per più di 30 minuti). Dopo l’incubazione, aggiungere la miscela di cotrasfezione a ciascuna capsula di Petri lentamente, goccia a goccia. Porre le piastre all’interno di un’incubatrice a CO2 a 37 °C per 6 ore. Dopo 6 ore, rimuovere il DMEM privo di siero e sostituirlo con un terreno DMEM completo. Raccogliere il virus a 48-60 ore dopo la cotrasfezione. Raccolta e conservazione del virus: Raccogliere le particelle a 48 ore dalla cotrasfezione. Staccare le cellule pipettando ripetutamente sulla superficie del monostrato e raccogliere le cellule da ciascuna capanna, inserirle in provette da centrifuga da 15 mL e centrifugare a 400 x g per 5 minuti. Raccogliere il surnatante e farlo passare attraverso un filtro da 0,22 μM. Conservare lo pseudovirus Ha-CoV-2 a -80 °C. 2. Test di infettività virale Cellule e colture cellulari: Mantenere cellule HEK293T(ACE2/TMPRSS2) nel terreno di Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco contenente il 10% di FBS inattivato al calore, 50 unità/mL di penicillina e 50 μg/mL di streptomicina. Semina di cellule HEK293T (ACE2/TMPRSS2): il giorno prima del test di infettività virale, seminare cellule HEK293T(ACE2/TMPRSS2) in una piastra a 96 pozzetti in 50 μL di terreno DMEM completo. Per ogni piastra da 96 pozzetti, seminare 2,5 x 104 cellule in ciascun pozzetto e sono necessarie un totale di 2,5 x 106 cellule per una piastra. Posizionare la piastra a 96 pozzetti in un incubatore a CO2 a 37 °C per una notte. Infezione di HEK293T (ACE2/TMPRSS2): utilizzare le particelle delle varianti di Ha-CoV-2 per infettare le cellule HEK293T (ACE2/TMPRSS2). La mattina dell’infezione, rimuovere 50 μL di DMEM dalla piastra preseminata a 96 pozzetti. Sostituire il terreno con 50 μL di Ha-CoV-2 Wild-type, Delta o Omicron per 18 ore a 37 °C.NOTA: Il protocollo può essere interrotto qui fino a quando l’infezione non ha raggiunto le 18 ore di incubazione e la piastra è pronta per essere analizzata tramite il test della luciferasi. Il successo dell’infezione è determinato dal test della luciferasi risultante dal gene reporter della luciferasi espresso nelle cellule infette, quindi più segnale viene prodotto, più successo ha l’infezione della variante Ha-CoV-2. Test della luciferasi: Dopo 18 ore di incubazione, aggiungere 7,5 μL di tampone di lisi cellulare direttamente in ciascun pozzetto e mescolare agitando orbitalmente per 2 minuti. Lisare le cellule nel tampone di lisi per almeno 5 minuti a temperatura ambiente. Preparare la soluzione del saggio della luciferasi Firefly mescolando la soluzione di D-luciferina con la soluzione del saggio della luciferasi Firefly in un rapporto 1:50. Per un’intera piastra a 96 pozzetti, combinare 3 mL della soluzione di substrato di luciferasi con 60 μL della soluzione di D-luciferina con 2940 μL della soluzione tampone luciferasi Firefly. Aggiungere 25 μL della soluzione del saggio luciferasi Firefly ai lisati cellulari e mescolare la piastra agitando orbitalmente per 1 minuto. Analizzare l’attività della luciferasi utilizzando un lettore di micropiastre per luciferasi commerciale. 3. Estrazione di RNA di Ha-CoV-2 e PCR quantitativa con trascrittasi inversa (RT-qPCR) Estrazione dell’RNA virale: estrarre l’RNA virale dalle particelle Ha-CoV-2 Wild-type e dalle varianti Delta e Omicron di Ha-CoV-2 utilizzando un kit di estrazione dell’RNA virale commerciale, seguendo le istruzioni del produttore. Conservare l’RNA virale estratto a -80 °C o utilizzarlo immediatamente per la RT-qPCR. RT-qPCR: Eseguire la RT-qPCR sull’RNA virale utilizzando una miscela master in un’unica fase. Eseguire la reazione in una macchina PCR commerciale. Si noti che il bersaglio dell’amplificazione è l’RNA genomico di Ha-CoV-2. Utilizzare il DNA vettoriale Ha-CoV-2 come standard per creare una curva standard e calcolare il numero di copie di RNA di ciascuna variante. 4. Saggio degli anticorpi neutralizzanti Semina di cellule HEK293T(ACE2/TMPRSS2): il giorno prima del test, seminare cellule HEK293T(ACE2/TMPRSS2) in una piastra a 96 pozzetti in 50 μL di terreno DMEM completo. HEK293T celle (ACE2/TMPRSS2) vengono acquistate commercialmente. Per contare le cellule, prelevare 20 μL di cellule da un matraccio T75 contenente HEK293T(ACE2/TMPRSS2) e mescolare con 20 μL di soluzione blu di tripano. Aggiungere 20 μL di questa miscela alla camera di conteggio delle cellule e contare il numero di cellule per mL. Per seminare una piastra a 96 pozzetti per l’infezione, utilizzare 2,5 x 104 cellule per pozzetto e saranno necessarie 2,5 x 106 cellule in totale. Porre la piastra a 96 pozzetti in un incubatore CO2 a 37 °C per una notte. Dosaggio degli anticorpi neutralizzanti: in una piastra sterile in polipropilene a 96 pozzetti, preparare l’anticorpo neutralizzante standard 27BV e la miscela di Ha-CoV-2. Aggiungere 8 μL di 27BV (45 mg/mL) alla piastra ed eseguire diluizioni seriali dell’anticorpo con 6 μL di DMEM esente da siero.NOTA: Assicurarsi di scambiare i puntali delle pipette tra un trasferimento di pozzetti e l’altro e assicurarsi che il mezzo privo di anticorpi e siero siano miscelati accuratamente per produrre risultati accurati. All’anticorpo diluito in serie, aggiungere 54 μL di particella di Ha-CoV-2 e mescolare il virus e l’anticorpo. Pre-incubare le particelle di Ha-CoV-2 con 27BV diluito in serie per 1 ora a 37 °C al 5% di CO2 . Dopo l’incubazione di 1 ora, applicare 50 μL della miscela di anticorpi e Ha-CoV-2 sulla piastra a 96 pozzetti contenente le cellule HEK293T(ACE2/TMPRSS2) (2,5 x 104 cellule per pozzetto) seminate il giorno prima. Per i controlli, lasciare almeno tre pozzetti contenenti solo le celle HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Aggiungere 50 μL di terreno completo a questi pozzetti per fungere da pozzetti non infetti per il segnale di fondo delle letture del saggio della luciferasi.NOTA: Il protocollo può essere interrotto fino a quando l’infezione non ha raggiunto le 18 ore di incubazione a 37 °C, quindi la piastra è pronta per essere analizzata tramite il test della luciferasi. Test della luciferasi: Dopo 18 ore di incubazione, aggiungere 7,5 μL di tampone di lisi direttamente a ciascun pozzetto e mescolare agitando orbitalmente per 2 minuti. Lisare le cellule nel tampone di lisi per almeno 5 minuti a temperatura ambiente. Preparare la soluzione del saggio della luciferasi Firefly mescolando la soluzione di D-luciferina con la soluzione del saggio della luciferasi Firefly in un rapporto 1:50. Per un’intera piastra a 96 pozzetti, combinare 3 mL della soluzione di substrato di luciferasi con 60 μL della soluzione di D-luciferina con 2940 μL della soluzione tampone luciferasi di lucciola. Aggiungere 25 μL della soluzione del saggio luciferasi Firefly ai lisati cellulari e mescolare la piastra agitando orbitalmente per 1 minuto. Analizzare l’attività della luciferasi utilizzando un lettore di micropiastre per luciferasi commerciale. 5. Quantificazione e analisi statistica Raccolta dati: eseguire i saggi di infezione e luciferasi in triplice copia come indicato (Figura 1). Quantificare l’espressione della luciferasi con le letture del saggio della luciferasi. La media è il valore medio delle tre letture del saggio della luciferasi. Le letture del segnale di fondo provenienti da pozzi non infetti vengono sottratte da questo valore medio. La deviazione standard (SD) è determinata dal valore medio delle letture del saggio della luciferasi. Analisi dei dati: tracciare l’attività di neutralizzazione degli anticorpi e calcolare i valori di ID50 (dosaggio di inibizione del 50%) utilizzando software grafici commerciali. Il valore ID50 è definito come la diluizione inibitoria degli anticorpi alla quale si ottiene una riduzione del 50% dell’infezione delle cellule HEK293T(ACE2/TMPRSS2) (sulla base delle letture del saggio della luciferasi).