El éxito de la transcriptómica y multiómica de una sola célula/núcleo único depende en gran medida de la calidad de las células/núcleos. Por lo tanto, el aislamiento de células/núcleos de los tejidos y su purificación debe estar altamente estandarizado. Este protocolo describe la preparación de núcleos del cerebro y la médula ósea para el ensayo multioma de un solo núcleo aguas abajo.
El análisis de una sola célula se ha convertido en el enfoque de elección para desentrañar la complejidad de los procesos biológicos que requieren evaluar la variabilidad de las respuestas celulares individuales al tratamiento o la infección con resolución de una sola célula.
En los últimos 10 años se han desarrollado muchas técnicas para el perfil molecular de una sola célula, y se han comercializado varias tecnologías específicas. El perfil de una sola célula basado en gotas de 10X Genomics es una tecnología generalizada que ofrece reactivos listos para usar para el perfil transcriptómico y multiómico de una sola célula. La tecnología incluye flujos de trabajo para la secuenciación de ARN de una sola célula y de un solo núcleo (scRNA-Seq y snRNA-Seq, respectivamente), scATAC-Seq, perfil inmunitario de una sola célula (secuenciación BCR/TCR) y multioma. Este último combina información transcripcional (scRNA-Seq) y epigenética (scATAC-Seq) procedente de la misma célula.
La calidad (viabilidad, integridad, pureza) de las suspensiones unicelulares o de un solo núcleo aisladas de los tejidos y analizadas por cualquiera de estos enfoques es fundamental para generar datos de alta calidad. Por lo tanto, los protocolos de preparación de muestras deben adaptarse a las particularidades de cada tejido biológico y asegurar la generación de suspensiones celulares y núcleos de alta calidad.
En este artículo se describen dos protocolos para preparar muestras de cerebro y médula ósea para la canalización de genómica multiome 10X aguas abajo. Los protocolos se realizan paso a paso y cubren la disociación de tejidos, la clasificación celular, el aislamiento de núcleos y el control de calidad de la suspensión de núcleos preparados que se utiliza como material de partida para la partición celular y el código de barras, la preparación de bibliotecas y la secuenciación. Estos protocolos estandarizados producen bibliotecas de núcleos de alta calidad y datos robustos y confiables.
Durante muchos años, las técnicas unicelulares han sido el estándar de oro para el análisis de procesos biológicos. Inicialmente se restringieron al fenotipado unicelular a través de microscopía, citometría de flujo y ensayos similares. Un gran avance en el análisis de una sola célula se produjo con el desarrollo de enfoques para el perfil molecular de una sola célula, en particular la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-Seq) que permitió caracterizar todo el transcriptoma de células individuales. Muy potente, scRNA-Seq genera información sobre el estado transcripcional de una célula en una condición y un punto de tiempo específicos. Sin embargo, no proporciona visibilidad sobre la regulación génica que impulsa la transcripción, ni sobre las modificaciones moleculares que se producen a lo largo del tiempo. Para superar esta limitación, se han invertido muchos esfuerzos en el desarrollo de ensayos multiómicos unicelulares que permitan el análisis de múltiples factores y procesos a partir de una misma célula 1,2,3,4. La primera medición exitosa de dos modalidades dentro de células individuales se produjo mediante la vinculación de patrones de expresión de proteínas de superficie múltiple con el transcriptoma completo de células individuales en el enfoque CITE-Seq5. Las evoluciones más recientes combinan la expresión génica con la accesibilidad a la cromatina (Ensayo de cromatina accesible a la transposasa mediante secuenciación, ATAC-Seq), capturando así simultáneamente las modalidades transcriptómicas y epigenómicas en las mismas células (por ejemplo, sci-CAR)6. Las primeras soluciones comerciales que permitieron asociar la transcriptómica con el fenotipo celular o con cambios epigenéticos de la misma célula vinieron de la mano de 10X Genomics.
Los experimentos para el perfil molecular de una sola célula contienen los siguientes pasos: (1) disociación de tejidos o preparación de suspensiones de una sola célula; (2) purificación celular y/o aislamiento de núcleos; (3) partición y código de barras; (4) construcción de bibliotecas y control de calidad; (5) secuenciación de nueva generación; (6) Análisis de datos. Si bien los pasos (3)-(6) pueden variar significativamente según la tecnología empleada, los pasos iniciales son generalmente comunes a todos ellos. La calidad de la suspensión de células/núcleos preparada determinará el resultado general del experimento. Dependiendo del tipo de tejido, la obtención de suspensiones unicelulares/nucleales de alta calidad puede ser un desafío. Las particularidades de algunos tejidos, como el corazón, el músculo, el cerebro, el pulmón, el intestino y otros, requieren métodos de disrupción tisular y aislamiento de núcleos adaptados a cada tipo de muestra, con el fin de garantizar la producción de núcleos de alta calidad para el análisis molecular 7,8,9,10 . Los métodos de disrupción tisular y los protocolos de disociación pueden ser mecánicos, enzimáticos (p. ej., una mezcla de colagenasas y DNasa) o una combinación de ambos, y se pueden realizar manualmente o mediante instrumentos (p. ej., Qiagen DSC-400, gentleMACS).
Las técnicas unicelulares se han convertido en una herramienta de elección para la investigación biomédica. En neurobiología, la diversidad celular en el cerebro y la complejidad de sus funciones requieren análisis de alta resolución y alto rendimiento para la visualización de poblaciones celulares raras y para evaluar su heterogeneidad 11,12,13,14. La vinculación de la identidad celular y los mecanismos reguladores de genes de las células individuales proporciona información sobre el desarrollo y la fisiología del cerebro. Otro ejemplo son los estudios de la respuesta inmunitaria en el contexto de enfermedades infecciosas, autoinmunes o cancerosas, que se basan en gran medida en análisis de células individuales. La heterogeneidad de los subconjuntos de células inmunitarias y la complejidad de su actividad e interacciones con otros tipos de células requieren una resolución de una sola célula para descifrar los mecanismos subyacentes a la respuesta inmunitaria. Las células inmunitarias se originan en la médula ósea, donde los progenitores hematopoyéticos están compuestos por células que se diferencian gradualmente y adquieren y pierden marcadores de superficie celular a lo largo de un proceso escalonado antes de salir de la médula ósea a su hogar en la periferia. El análisis de una sola célula permite una caracterización minuciosa de las etapas de desarrollo celular. Se puede lograr a través del fenotipado de una sola célula, realizado convencionalmente mediante citometría de flujo multiparamétrica. Sin embargo, se ha demostrado que las firmas transcriptómicas de una sola célula revelan una identificación más precisa de los subtipos de células progenitoras, ya que estas células se distribuyen en grupos que caen entre sí y, por lo tanto, pueden identificarse erróneamente cuando se utiliza un enfoque de marcador de superficie celular gruesa15. Un número creciente de estudios descubren las modificaciones epigenéticas que las células madre hematopoyéticas y progenitoras (HSPC) pueden adquirir a partir de la exposición a diversos agentes, lo que lleva a un impacto significativo en la capacidad de respuesta a largo plazo del sistema inmune 16,17,18,19. Las novedosas tecnologías multiómicas permiten estudiar estos procesos con resolución de una sola célula.
Se han descrito muchos protocolos para el aislamiento de células y núcleos para muestras de cerebro 11,20,21,22 y médula ósea 23,24. Para minimizar el sesgo debido a la variabilidad experimental, es necesario validar protocolos optimizados de preparación de un solo núcleo para la secuenciación transcriptómica y epigenómica conjunta de una sola célula, asegurando así la reproducibilidad de los ensayos multiómicos de una sola célula.
Aquí, se describen dos protocolos robustos para la preparación de núcleos a partir de (1) tejido cerebral fresco congelado y (2) HSPC de médula ósea fresca para el análisis multioma de una sola célula posterior (Figura 1).
Figura 1: Representación esquemática de los protocolos para el aislamiento de núcleos de tejidos cerebrales y de médula ósea recién congelados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La preparación de suspensiones celulares o de núcleos de alta calidad es de crucial importancia para el éxito de los análisis RNA-Seq y multiómicos unicelulares o unicelulares 29,30,31. Aquí, hemos descrito protocolos para la preparación de muestras y el aislamiento de núcleos para ensayos multioma de dos tipos de tejido: cerebro y médula ósea.
El protocolo cerebral descrito en este trabajo permite la recuperación de núcleos de alta calidad a partir de tejido cerebral recién congelado. Incluye los siguientes pasos: disrupción del tejido congelado, aislamiento de núcleos, purificación de núcleos y control de calidad del material preparado. El tejido cerebral está compuesto por muchos tipos de células diferentes, y el procedimiento de disociación de tejidos y aislamiento de núcleos debe preservar las proporciones de poblaciones celulares presentes en el tejido inicial. Aquí, la composición del tampón de lisis y el tiempo de incubación se optimizaron para permitir una lisis completa y suave de todas las poblaciones celulares que componen el tejido.
El protocolo de HSPCs de médula ósea es algo diferente, ya que requiere un paso adicional al comienzo del experimento para aislar la población celular de interés de una suspensión celular heterogénea. Después de la recolección de tejido fresco, se lisan los glóbulos rojos y la muestra se enriquece para el subconjunto de células de interés. Se lisan las células objetivo, se aíslan los núcleos y se controla la calidad del material preparado.
10X Genomics proporciona varios protocolos validados para el aislamiento de núcleos en numerosos tejidos diferentes32,33. La empresa también comercializa un kit de aislamiento de núcleos con una línea sencilla para aislar núcleos de tejidos validados34. Sin embargo, estos protocolos necesitan una optimización adicional para adaptar las particularidades de ciertas muestras. Un ejemplo son las muestras que requieren trabajar con una entrada de celda baja. Para estas muestras, los pasos más desafiantes son las centrifugaciones, que deben ser lo suficientemente estrictas para limpiar la muestra y lo suficientemente suaves para evitar la pérdida de células/núcleos. Con el protocolo aquí descrito, hemos adaptado el Protocolo Demostrado de Genómica 10X – Aislamiento de Núcleos para Secuenciación de Célula Única Multioma ATAC + GEX (CG000365 – Rev C)27 para encontrar un buen equilibrio entre estos dos requisitos. Como se demuestra en el ejemplo de la preparación de núcleos a partir de HSPC clasificados, hemos mejorado la recuperación de núcleos sin afectar a la calidad de la muestra.
Un desafío adicional es el paso de lisis de las células purificadas para el aislamiento de núcleos. Las condiciones de lisis más duras y los tiempos de incubación más largos pueden dañar los núcleos y, por lo tanto, afectar la calidad de los datos de secuenciación. La Figura 5 muestra imágenes representativas de núcleos de muestras de médula ósea en diferentes tiempos de incubación con tampón de lisis e ilustra cuán diferente podría ser el estado de los núcleos dependiendo de la lisis celular. En el ejemplo de las HSPC, hemos identificado la lisis de 3 minutos como la condición que da lugar a la mayor proporción de núcleos intactos de aspecto saludable y la menor proporción de núcleos dañados. Los tiempos de incubación de lisis deben optimizarse para cada nuevo tipo de muestra.
Figura 5: Control de calidad de los núcleos por microscopía. Se muestran imágenes representativas de campo claro de núcleos aislados de la médula ósea de ratón con (A) núcleos intactos y (B) dañados. Barra de escala 5 μm. Las imágenes se tomaron con un microscopio invertido utilizando un objetivo ELWD NA 0.60 de 40x y un zoom digital de 1.5x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Ambos protocolos detallados en este trabajo se basan en la purificación de células o núcleos específicos mediante instrumentos FACS de alto rendimiento. Este paso es de crucial importancia para los protocolos de preparación de una sola célula/núcleos en los que se van a aislar subconjuntos raros de células a partir de suspensiones heterogéneas. En estos, como en el ejemplo que se muestra aquí para la clasificación de HSPC, es posible que se requiera un panel de citometría de flujo de alta dimensión para habilitar la “compuerta” en la población celular de interés. La clasificación es extremadamente rápida y precisa, lo que lleva a una pureza superior al 95% de los subconjuntos de celdas clasificados. Este enfoque expone la suspensión celular a una presión de hasta 70 psi y, por lo tanto, puede ser limitante para la clasificación de células frágiles (por ejemplo, células dendríticas, neutrófilos), ya que puede causar la ruptura de su membrana celular. En estos casos, se deben seleccionar soluciones alternativas para la purificación celular, incluida la clasificación magnética, la aplicación de instrumentos de nueva generación (por ejemplo, CellenOne, Cellenion; MACSQuant Tyto, Miltenyi)35,36, o sistemas basados en gotas (p. ej., ODIN, Sensific)37. Sin embargo, la lenta velocidad de clasificación de estas tecnologías, con una clasificación celular que dura horas en lugar de minutos, es un fuerte factor limitante para la aplicación de estos enfoques en la preparación de células viables para Multiome y otras aplicaciones de una sola célula basadas en el análisis de grandes números de células.
Para la purificación de núcleos aislados del tejido, FACS es el método de elección debido a su rendimiento y a la pureza del material aislado. Los núcleos no son sensibles a la presión, y los aislados de tejido filtrados se pueden purificar fácilmente a través del clasificador de células. Si el laboratorio no está equipado con un instrumento FACS, existen otras alternativas, algo menos eficientes pero suficientemente buenas. Algunos ejemplos son la ultracentrifugación o el uso de pequeños equipos como MARS (Applied Cell) que separa las partículas en función de su diferencia de tamaño, mediante ondas acústicas; arandela laminar CURIOX que utiliza las propiedades hidrofóbicas de las suspensiones celulares/nucleos; o LEVITAS bio que se basa en las propiedades físicas de las células (levitación) para separarlas de los desechos.
Aquí, describimos protocolos para obtener un alto número de núcleos y la mejor pureza para el protocolo Multiome aguas abajo. La clasificación FACS y los pasos repetidos de centrifugación dan como resultado una pérdida sustancial del material inicial. Por esta razón, en el protocolo para la preparación de núcleos del cerebro que describimos aquí se requiere material de partida lo suficientemente abundante como para dar lugar a la recolección de al menos 500.000 núcleos después de la clasificación FACS. Se deben aplicar protocolos alternativos si no se puede cumplir este criterio. Cuando se trabaja con poblaciones celulares raras o pequeñas secciones de tejido, la cantidad disponible de material inicial puede ser un factor limitante. Para abordar este problema, es posible mejorar la recuperación de núcleos (a) reduciendo el volumen de lisis, (b) reduciendo el volumen de lavado, (c) utilizando un solo lavado con tiempo de centrifugación extendido para tratar de mejorar la recuperación como se indica en los protocolos de 10X Genomics para el aislamiento de núcleos de baja entrada celular. Para el análisis multiómico de material de bajo contenido, vale la pena considerar aplicaciones basadas en placas como scNMT, SNARE-seq y Paired-seq38 que requieren muchas menos muestras de entrada.
En resumen, hemos descrito dos protocolos robustos para la preparación de núcleos del cerebro y de la médula ósea para el análisis posterior de Multiome. Estos protocolos son aplicables en cualquier proyecto científico que requiera suspensiones de núcleos individuales de alta calidad a partir de estos dos tipos de tejidos, independientemente de la cuestión científica planteada. Nuestro grupo ha estado aplicando el protocolo de aislamiento de núcleos cerebrales en estudios de desarrollo cerebral tras la inactivación de varios genes diana y en estudios de respuesta inmune en el contexto de enfermedades neurológicas. Estamos utilizando el protocolo de aislamiento de núcleos de médula ósea para descifrar la participación de varias subpoblaciones hematopoyéticas en el establecimiento del sistema inmune.
The authors have nothing to disclose.
Ana Jeemin Choi recibió un estipendio del Programa Internacional de Doctorado Pasteur – Universidad de París (PPU).
18 G x 1 ½ (1.2 mm x 38 mm) Agani needles | Terumo | AN*1838S1 | |
15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
5 mL round bottom FACS tube with cell strainer cap 35 µm | falcon | 352235 | |
50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
7-AAD | BD pharmagen | 559925 | |
ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
APC anti-mouse CD117 (c-Kit) | BioLegend | 105812 | Clone: 2B8 |
APC/Cyanine 7 anti-mouse CD16/32 (FcγR) | BioLegend | 101328 | Clone: 93 |
BD FACSAria III | BD Biosciences | non-applicable | |
BD FACSDiva Software v8.0.1 | BD Biosciences | non-applicable | |
Bovine Serum Albumin stock solution 10% | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
Cell staining buffer | Biolegend | 420201 | |
CFI Suprplan Fluor ELWD 40XC ON 0.6 | Nikon | non-applicable | |
CMOS camera Prime 95B 25 mm | Photometrix | non-applicable | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
Countess cell counting chamber slide | Invitrogen | C10283 | |
Coverglass 24 mm x 24 mm 0.13-0.17 mm | Brand | BR470819 | |
Digitonine 5% | Invitrogen | BN2006 | |
Disposable Scalpels | Swann-Morton | 0508 | |
DMEM (1x) + GlutaMAX-I | Gibco | 31966-021 | |
DPBS (10x) | Gibco | 14200-067 | |
DTT | Sigma aldrich | 646563 | |
Epifluorescence inverted microscope Nikon Ti2 -E | Nikon | non-applicable | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL | Eppendorf | 30123603 | |
Ethanol 70% | VWR | 83801.290 | |
FITC anti-mouse CD34 | Invitrogen | 11-0341-85 | Clone: RAM34 |
Forceps for dissection | FST | 11152-10 | |
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 11533387 | |
Dounce Homogeniser 2 mL | Bellco glass | 1984-10002 | Pestle “A” Large Clearance: .0030-.0050″ and Pestle “B” Small Clearance: .0005-.0025″ |
LIVE/DEAD fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L34957 | |
Magnesium chloride solution 1 M | Sigma aldrich | M1028 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5424R | |
Mounting medium Fluoromount-G | invitrogen | 00-4958-02 | |
Nonidet P40 substitute | Sigma aldrich | 74385 | |
Nuclease free water | ThermoFischer | AM9932 | |
Nuclei buffer 20x | 10X Genomics | 2000153/2000207 | |
Nuclei isolation kit EZ prep | Sigma Aldrich | NUC-101 | |
OneComp eBeads compensation beads | Invitrogen | 01-1111-41 | |
Pacific Blue anti-mouse lineage cocktail (including anti-mouse CD3, Ly-6G/Ly-6C, CD11b, CD45R/B220, TER-119) |
BioLegend | 133310 | Clones (in the same order as the antibodies listed): 17A2, RB6-8C5, M1/70, RA3-6B2, Ter-119 |
PCR Tube Strips 0.2 mL | Eppendorf | 951010022 | |
PE anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend | 122507 | Clone: E13-161.7 |
Petri dish 100 mm x 20 mm OPTILUX | Falcon | 353003 | |
Ply-L-lysine 0.01% sterile-filtered suitable for cell culture | Sigma | P4707 | |
Printed microscope slides 8 well 6 mm numbered | Epredia | ER-301B-CE24 | |
Protein LoBind Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30108116 | |
Recombinant Rnase inhibitor 5000 U | Takara | 2313A | |
Scissors for dissection | FST | 14090-09 | |
Sodium chloride solution 5 M | Sigma aldrich | 59222C | |
Syringe filters, PES, 0.2 µm | Fisher Scientific | 15206869 | |
Transparent nail polish | any | non-applicable | |
Trizma Hydrochloride solution pH 7.4 | Sigma aldrich | T2194 | |
Trypan Blue 0.4% | gibco | 15250061 | |
Tween 20 | Biorad | 1662404 | |
UltraPure Distilated Water Dnase/Rnase Free | Invitrogen | 10977-035 |