瞬态吸收数据的处理、拟合和解释简介

1. 准备拟合数据 将 SAMPLE 数据集加载到 Fitting 软件中。数据如 补充图 1 所示。 当实验的光学检测窗口内存在散射激发光时，使用减去 散射光 选项（补充图2）。如果数据中不存在散射激发光，请继续执行步骤 1.5。注意：当激发波长落在光学窗口内时，最常观察到散射光。散射光在激发波长（或某些衍射阶数，或OPA中产生的波长）处表现为尖锐的负（漂白）特征，不随时间变化。 单击“ 曲面 ”菜单，然后单击“减去 散射光 ”选项（补充图 2）。将出现一个新窗口。 在新窗口中，单击 箭头 按钮将背景光谱的数量设置为平均值（补充图3），以便执行背景校正。使用十个光谱提供了一个很好的起点，并且可以根据需要调整数量。单击 “接受 ”以执行减法（继续执行步骤 1.7）。注意：背景光谱是从数据集中存在的第一个光谱中提取的，然后根据需要使用尽可能多的背景光谱在时间上向前移动，以提供背景信号的平均值;但是，使用过多将开始使用包含目标信号的光谱，因此不要使用太多。对于较长的时间窗数据，散射特征可能不会出现在数据的时间窗结束时。如果时间窗口超过相机集成时间，或者根据 TA 实验的构造方式，或其他原因，可能会发生这种情况。要更正此问题，可以使用 补充文件 3 中概述的设置时间范围选项。 对于光学窗口中不存在散射光的数据，请单击“ 表面 ”菜单，然后单击“ 减去背景 ”选项。 在出现的窗口中，单击右下角的箭头按钮，将“光谱数”平均（选择 10），然后单击接受。注意：此选项中的背景光谱功能与“减去散射光”选项中的功能相同。从十个光谱开始提供良好的平均。可以使用更多的光谱，但必须注意不要使用太多，以避免包含包含感兴趣信号的光谱。Surface Xplorer 的用户手册描述了“减去散射光” 与“减去散射光”所应用校正的差异。更基本的“减去背景”校正。对工件16 应用适当的校正非常重要。 光学窗口边缘附近的数据可能具有非常低的信噪比，这是由于探头光谱的形状和/或样品吸收了过多的白光。这些区域的嘈杂数据使分析更加困难。删除频谱中这些无用的部分。单击光谱上的 结束波长 （左下角图块），输入新值（补充图4），然后单击 回车键。选择一个波长范围，以消除窗口边缘的噪声数据。对于提供的数据，范围为 340-680 nm。 完成光谱窗口到所需波长范围的调整。单击 “表面 ”菜单，然后单击 “裁剪 ”（补充图 5）。将出现一个弹出窗口。单击 “确定”。单击 “文件 ”菜单，然后单击“ 将文件另存为”。然后，单击 “确定”。关闭此数据集。注意：裁剪时要小心，因为该函数将沿波长和时间延迟轴裁剪数据，删除所有其他数据。确保时间延迟窗口包含要保留的数据部分。此外，强烈建议将任何裁剪的数据另存为新的、适当标记的文件，以便将原始数据图面完好无损地保留为备份。 对于在 fs 或 ps 时间尺度上收集的数据，必须应用啁啾校正。打开数据表面，仅使用与数据相同的实验设置中采集的溶剂或底物（无样品）。此示例称为“空白”实验运行。对“空白”数据（从步骤 1.2 到步骤 1.8）执行与对示例数据执行的步骤相同的步骤集。注意：强烈建议在与样品相同的条件下运行这种“空白”实验，但时间窗口较短（例如，~ −5 ps 至 5 ps），以确保在时间零附近有大量点。根据样品类型，这种“空白”运行应仅由溶剂或底物组成，并用于建立啁啾曲率。到目前为止，“空白”的准备应遵循与样本数据相同的背景校正和裁剪。如果未运行“空白”，则可以直接在数据集上进行啁啾校正。 开始啁啾校正过程。在热图磁贴（左上角）中，单击 十字准线 并将垂直线分量拖动到光谱的蓝色端。从光谱窗口起点附近的蓝色波长范围开始。单击“ 动力学 ”菜单，然后单击 “拟合溶剂响应”。注意：拟合溶剂响应只能在“空白”样品上执行，该样品不会产生任何超过时间零的信号。尝试将此拟合函数应用于包含感兴趣分子或材料数据的数据集将导致程序尝试拟合数据而不是 IRF（仪器响应函数）。对于“空白”样品，唯一存在的信号应该是由交叉相位调制产生的相干伪影。交叉相位调制仅在泵浦和探头光束重叠的地方发生，因此，可以使用“拟合溶剂响应”选项提供线性啁啾曲率的轨迹。对于没有附带“空白”的数据，需要手动放置点以用于校正，并在 补充文件 3 中进行了更详细的描述。 将打开一个新的“适合溶剂响应”窗口。单击 “适合 ”按钮（补充图 6）。拟合将使用高斯的一阶导数和二阶导数生成对仪器响应函数的拟合。单击 “保存 ”按钮，然后单击 “x ”关闭屏幕。注意：红色拟合线应在整个时间范围内与数据点（蓝色空心方块）很好地匹配，最重要的是在时间零（0.1-2.0 ps）附近看到的大特征。如果时间零附近有大量点，则拟合将最成功，这可以通过对“空白”实验使用较短的时间延迟窗口并保留大量点来实现。如果拟合似乎与数据点不匹配，请选中“添加高斯 （R0）”框并重试拟合。此选项将高斯之和添加到一阶导数和二阶导数中，并且可能更好地拟合此波长下的 IRF 特征形状。如果溶剂响应拟合仍然无法捕获 IRF 信号，请选择不同的波长。 执行此过程（步骤 1.10-1.11）至少五次，因为需要 5 个点才能正确纠正啁啾声。如果可能的话，这些点应该在整个光谱窗口中间隔开来。根据实验条件，某些溶剂/底物可能不会在光谱窗口的某些部分产生可观察到的信号。可以根据需要添加/使用更多点，以产生可接受的贴合度。完成后，关闭“空白”数据集。注意：用户单击 “保存”后，每个保存的点都会作为新行写入工作文件夹中的 Excel 文件。如果保存了不需要的点，则可以通过删除不需要的点的行从 Excel 文件中删除该点。 重新打开裁剪和背景减去的数据集。单击“ 表面 ”菜单，然后单击“ 啁啾校正 ”选项。这将打开一个带有三个窗口和右下角菜单的新屏幕（补充图 7）。 添加刚刚创建的啁啾校正。单击“ 从文件添加 ”选项，选择以“拟合系数”结尾的 Excel 文件，然后单击 “确定”。啁啾校正拟合现在显示在左上角窗口中，显示为带有 X 标记的黑线（补充图 8）。注意： 啁啾校正显示为实线;沿线的 X 标记是从拟合溶剂响应过程中产生的点。可以通过调整十字准线并单击 添加来手动添加点。也可以通过突出显示点并按 “删除”来删除点。可以通过在右下角的列表中输入值来手动编辑其他要点。最后，如果需要，还可以将当前校正保存为文件，以便以后使用 “保存到文件 ”按钮重复使用。 单击 “预览啁啾校正 ”按钮。这将暂时应用啁啾校正。观察左上角窗口中的校正，以确保数据在时间上已变平，并且不再可观察到曲率。如果对啁啾校正感到满意，请单击 “应用并退出 ”按钮。如果不满意，请重复步骤 1.10-1.14，选择更多（或不同）波长进行啁啾校正拟合，直到获得令人满意的校正。注意：应用啁啾校正会将时间零调整为预览中显示的拉直线。“空白”和数据图面之间可能存在一些时间错位。 单击 “文件 ”菜单，然后单击“ 将文件另存为”。键入文件的适当名称，以指示已应用啁啾校正。然后，单击 “确定”。 执行背景减法时，数据中的某些散射特征可能无法完全去除。这些特征会影响拟合并产生错误的拟合结果。在数据中找到应移除的任何此类要素。散射特征在负时区最容易识别。在左上角的热图磁贴中，单击十字 准线 并将其拖动到负时间区域。保持在负时间区域内，使用十字准线确定散射特征开始和结束的波长。请注意散射特征的波长范围（对于提供的数据集，特征范围为 654 nm 至 672 nm）。注意：在确定是否应删除要素时，请在时间轴上上下拖动水平十字准线以可视化要素的光谱范围。散射特征通常具有非常嘈杂的单波长动力学迹线，因此也可以使用动力学迹线来验证特征的光谱范围。 从较低（蓝色）波长（即 654 nm）开始，单击光谱（左下角图块）上的 右端波长 ，然后输入较低（蓝色）特征范围的值。 通过单击“ 表面 ”菜单来裁剪数据，然后单击 “裁剪”。单击弹出菜单中的 确定 。使用唯一的文件名保存裁剪的数据，以指示这是数据的哪一侧（建议使用蓝色或左侧）。关闭文件。 使用在步骤 1.16 中保存的应用的啁啾校正打开文件。继续到要素的较高（红色）波长范围。单击光谱上的 左端 波长（左下图块），然后输入特征较高范围的值。 通过单击“ 表面 ”菜单来裁剪数据，然后单击 “裁剪”。单击弹出菜单中的 确定 。使用唯一的文件名保存裁剪的数据，以指示这是数据的哪一侧（建议使用红色或右侧）。 通过单击“文件”（ File ） 菜单合并两个文件，然后单击 “合并多个曲面”（Combine Multiple Surfaces）。在新窗口中，选择数据的两边（即“左右”或“蓝色”和“红色”）。使用 ctrl + 单击 选择每个文件。验证是否在“文件名：”框中选择了两个文件，然后单击右下角的 “确定”。进度条完成后，数据已合并。注意：可以以这种方式组合任意数量的文件。数据可以在时间和波长轴上的多个切割中拼接在一起。 单击“ 文件 ”菜单，然后单击“ 将文件另存为 ”并选择一个唯一的文件名以指示它已合并（建议使用“组合”或“复合”）。然后，单击 “确定 ”保存文件。注意：有关如何从原始数据窗口保存数据以供以后显示和绘图的信息，请参阅第 3 节。热图（左上角图块）中的数据应如 图 3 所示，现在已准备好进行拟合。如 图3所示，可视化代表性光谱在步骤3.1.2中描述。 2. 执行拟合 加载正确准备的数据图面。 确定将执行哪个拟合并移动到相应的部分。注意：该协议提供了两个数据拟合选项：步骤2.3提供了单波长动力学迹线拟合，步骤2.4提供了全局分析拟合。 单波长拟合要设置单个动力学拟合，请将光标（在左上角或左下角的磁贴中）移动到所需的波长。单击“ Kinetics ”菜单，然后单击 “Fit Kinetic”。对于提供的数据集，从 632 nm 开始。 在打开的新窗口（补充图 9）中，请注意，主要拟合参数和种子值设置在窗口左上角的程序徽标下方，该区域旁边的框中，在“当前拟合 @ 波长”文本下。 单击 箭头 按钮以调整“有限生存期”框中的生存期数（即用于拟合数据的指数衰减数）。对于提供的数据集，选择 2 生存期。1 到 3 个生命周期是典型的起点。 如果数据信号超出收集的时间窗口，则应包含“无限”寿命分量。为此，请单击 “使用无限生存期 ”复选框。如果数据完全衰减到基线，请不要选中此框。对于提供的数据集，请勿选中该框。注意：“无限寿命”允许保持信号偏移（即，程序不会强制拟合衰减回基线）。当该波长的信号在实验的时间范围内没有衰减到基线时，需要使用无限分量。 输入寿命和相关振幅、仪器响应时间和零点时间的猜测值，以帮助拟合过程（补充图 10）。单击所需的参数。在值窗口中单击，键入一个猜测值，然后单击 初始猜测 按钮以设置该值。对于提供的数据集，适当的猜测值为：0 = 0 ps、IRF = 0.25 ps、A1 = 0.6、t1 = 100 ps、A2 = 0.08、t2 = 1100 ps。注：“0”是时间零的估计值，“IRF”是仪器响应时间，“A”是指给定指数的振幅（见公式3），“t”是寿命/时间常数。提供良好的猜测值有助于程序获得合理的拟合。选择数据集中 A 范围值内的“A”值。在动力学迹线中观察到显著变化的时间范围内选择“t”值。获得关于猜测值如何影响拟合的直觉的最佳方法是尝试几组猜测值并观察它们产生的拟合。如果这些参数中的一个或多个是已知的，则可以设置和“固定”该参数，使其不会随拟合而变化（补充图11）。 输入所有猜测参数后，单击 “适合 ”按钮。代表性拟合如 图 4 所示。注意：应用拟合将使用拟合线和可用于评估拟合质量的残差图填充数据图。拟合参数（如寿命和相关振幅、时间零点和仪器响应时间）也填充在左上角的框中。使用多个不同的拟合参数来确定生存期的数量以及包含/排除产生对数据的最佳拟合的“无限”时间分量。 通过单击 “保存 ”按钮保存拟合（补充图 9）。注意：有关如何从原始数据窗口保存数据以供以后显示和绘图的信息，请参阅第 3 节。 全局分析拟合单击“ 表面 ”菜单，然后单击“ 通过 SVD 的主成分 ”选项。此时将显示一个新窗口（补充图 12）。注：右上角窗口显示主动力学迹线，左下角显示主光谱。左上角的磁贴显示 由原始曲面与所选主成分创建的曲面之间的差值创建的残余曲面图。 单击 箭头 按钮以设置“主成分数”（补充图 12）。对于提供的数据集，选择 15。注意：在决定选择主成分的数量时，一种方法是不断增加数量，直到主光谱和主动力学迹线都类似于噪声模式。确定要选择多少个主成分的另一种方法是查看右上图块中图例左侧显示的权重系数值。继续添加主成分，直到此值达到 0.01。一般来说，建议在此基础上再添加一些，以达到良好的效果。这可能会导致选择多达 15 个或更多主成分。 单击 “保存 ”按钮。需要保存的主组件才能进入下一步。注意：每个主组件都是原始数据图面的简化复杂度表示形式。与要分析的原始数据相比，使用主成分将导致简化的表面。考虑数据表面的大多数主要特征对于获得准确的拟合非常重要，因此使用足够的主成分来捕获这些特征至关重要。使用更多的主成分不会影响配合。因此，如果对选择多少主成分有任何疑问，请使用更多的主成分而不是更少的主成分。请记住，使用过多可能会减慢验配软件的速度。 保存主组件后，程序将返回主屏幕，现在可以尝试全局拟合。单击 “曲面 ”菜单，然后单击“ 全局拟合 ”选项。将打开一个新窗口（补充图 13）。注意：主动力学迹线显示在右上角的磁贴中。左上角的磁贴将显示拟合曲面与原始曲面的比较。左下角的图块将显示拟合生成的衰减相关差分谱 （DADS）。最后，右下角的磁贴是可以设置拟合参数的地方，包括要使用的指数函数的数量以及是否使用无限函数。 使用“经验值”旁边的 箭头 按钮设置拟合中要包含的指数函数数。如果数据信号超出收集的时间窗口，则应包含“无限”寿命分量。为此，请单击 “使用偏移量 （Ainf）” 复选框。对于提供的数据集，选择 2，不要单击该框。如果数据完全衰减到基线，请不要选中此框。注意：在执行拟合之前，可以通过单击右下角框中全局拟合系数下的标签列来修复拟合参数。标签将变为红色，并更改为标签上有一个（固定）指示器。在右侧框中键入的任何值都将用于该参数，而不是根据拟合自由变化。在确定拟合值时应小心，因为这可能会使拟合结果产生偏差。 单击 “适合 ”按钮。适合进度将通过屏幕中央的小加载栏显示。完成拟合进度后，窗口将填充拟合数据（图 5 和 补充图 14）。目视检查拟合结果。注意：来自主动力学拟合和 DADS 的信息用于确定拟合是否值得保存或太差。通常，如果主迹线的拟合与数据匹配良好，并且图中没有 特征或特征很少，则可以接受拟合。通过更改生存期和/或选中/取消选中“使用偏移 （Ainf）”按钮，可以轻松检查多个拟合。在检查拟合参数的多种变化后产生的最佳拟合应被接受。 单击 “保存 ”按钮。这会将当前显示的拟合度与数据一起保存在 Excel 文件中。注意：Excel 文件保存在与数据集相同的文件位置。如果执行了其他拟合并需要保存，它们将覆盖任何以前的版本。因此，在生成和保存新拟合之前，请为任何旧拟合指定一个唯一的名称。从拟合中保存的参数仅包括时间零、IRF、生存期及其随附的 DADS。此文件不包含有关 绘图或主动力学迹线拟合的任何信息。步骤 3.3 中概述了保存主动力学迹线。有关如何保存原始数据窗口中的数据以供以后显示和绘制的信息，请参阅步骤 3.0。 3. 从拟合软件中提取原始数据和拟合以进行绘图 注意：从单波长拟合或全局分析产生的原始数据或拟合可以导出到 csv 文件，这些文件可以在一系列其他程序中打开。 提取原始数据进行绘图要导出数据集的热图，请单击 “文件 ”菜单，然后单击 “导出到 CSV ”（补充图 15）。这将打开一个窗口，单击 “确定 ”将csv文件保存在与数据文件相同的目录中，打开与数据文件同名。注意：或者，可以通过右键单击热图窗口并单击 “将数据导出到剪贴板”来导出原始数据。这将暂时保存数据，以便将其粘贴到用户选择的软件文档中。将数据粘贴到 Excel 文件中，然后保存数据。 多个光谱可以显示在窗口中进行比较或用于制作图形。将 水平光标 （在热图中，左上角）拖动到所需的时间点。按 Ctrl + S 选择频谱并将其保存在频谱窗口（左下角）中。根据需要添加尽可能多的时间点以显示数据的进展（5-10 个光谱），如 图 3 所示。注意：选择用于表示数据的光谱数量和这些光谱的时间排列可能在很大程度上取决于特定的样品和实验条件。上述建议是一般准则，但实验的细节应决定强调数据集的哪些部分。 通过右键单击包含光谱的窗口导出为数据。单击“ 将数据导出到剪贴板 ”选项。数据是临时保存的。将此数据粘贴到所需的软件文档（即 Excel）中并保存。 多个动力学轨迹可以以与光谱窗口相同的方式显示在动力学窗口中。将 垂直光标 （在热图中，左上角）拖动到所需的波长。按 Ctrl + X 选择时间轨迹并将其保存在动力学窗口（右上角）中。根据需要添加任意数量的时间点。这将暂时将当前动力学迹线保存在窗口中。 通过右键单击包含动力学迹线的窗口导出为数据。单击“ 将数据导出到剪贴板 ”选项。数据是临时保存的。将此数据粘贴到所需的软件文档（即 Excel）中并保存。 从单波长拟合中提取数据进行显示单击“动力学”（ Kinetics ） 菜单，然后单击 “拟合动力学”（Fit Kinetic ） 以打开包含拟合数据的窗口。 右键单击 适合 窗口（即单个适合窗口中的中央磁贴）。单击 将数据导出到剪贴板。这将暂时保存它，以便可以将其粘贴到其他软件程序中。注意：无法导出拟合数据下方的残差图，而必须从拟合数据重新创建。拟合会导出原始数据和拟合线，然后可用于重新创建残差。残差是通过从每个时间点的数据中减去拟合值，并创建类似于“拟合动力学”窗口中显示的图来创建的。 将此数据粘贴到所需的软件文档（即 Excel）中并保存。注意：导出到剪贴板将仅包括拟合中使用的每个指数的原始数据和拟合线数据。拟合的参数（如寿命、振幅等）将不包括在内，必须通过从拟合软件复制值来导出。 从全局生命周期分析中提取数据以进行显示和分析单击“ 曲面 ”（Surface） 菜单，然后单击“ 全局拟合”（Global Fit ） 选项以打开包含拟合数据的窗口。 需要分别调整主成分（右上图）和 DADS（左下图）的光密度和时间延迟/波长轴值的精度。将鼠标悬停在主组件窗口上，直到设置框出现在右下角。 快速单击 x.xx 按钮，将鼠标悬停在“精度”上，然后单击菜单中的 6 以设置要包含的小数位数。 将鼠标悬停在主组件窗口上，直到设置框出现在右下角。快速单击 y.yy 按钮，将鼠标悬停在“精度”上，然后单击菜单中的 6 以设置要包含的小数位数。 右键单击 “主动力学迹线”（Principal Kinetic Traces） 窗口。单击 将数据导出到剪贴板。这将暂时保存它，以便可以将其粘贴到其他软件程序中。 将此数据粘贴到所需的软件文档（即 Excel）中并保存。注意：数据将保存为一系列列，首先包含时间延迟，然后是主动力学轨迹，然后是拟合线。在准备全局分析时，将为选择的每个主成分提供一组。DADS谱图已保存为步骤2.4.7中拟合程序的一部分。