Optimierte automatisierte Analyse der homöostase-Modulation lebender neuronaler Mitochondrien durch isoformspezifische Retinsäurerezeptoren

Zelluläre Mitochondrien befinden sich im Zentrum aller physiologischen Zustände, und ein gründliches Verständnis ihrer Homöostase (Mitostase) und ihres Verhaltens ist von größter Bedeutung, um eine pharmakologische Behandlung für eine Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Krebs und Alzheimer, zu identifizieren ^1,2.

Mitochondrien spielen eine entscheidende zelluläre Rolle bei der Energiehomöostase, der ATP-Erzeugung, der Kalziumpufferung und der ROS-Regulation, und die Mitostase ist für die Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase unerlässlich, da molekulare Chaperone energieabhängig sind³. Diese erfordern eine konstante und dynamische Netzwerkmodulation und -anpassung, um die zellulären Bedürfnisse effizient zu erfüllen, und der Mitochondrientransport wird durch verschiedene Signalwege reguliert; frühere Arbeiten haben einen solchen Signalweg beschrieben, den der Retinsäurerezeptoren (RARs)^4,5. Retinsäure (RA) fördert das Wachstum von Axonen und Neuriten durch RAR-Aktivierung. In primären kortikalen Neuronen der Maus fördert die Aktivierung von RAR-β das mitochondriale Wachstum, die Geschwindigkeit und die Beweglichkeit im Neuriten⁶.

In Anbetracht der Anpassungsfähigkeit und Dynamik des mitochondrialen Netzwerks ist die Möglichkeit, die Mitostase in “Echtzeit” zu bewerten, nicht nur für die Untersuchung der Energiehomöostase, sondern auch für die Proteostase, die Zellgesundheit, die Proliferation oder die Signalübertragung unerlässlich. Eine häufig verwendete Methode zur Beurteilung der Mitostase beruht auf der konfokalen Mikroskopie nach Hervorhebung der Mitochondrien mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder -marker sowie einem spezifischen Mikroskopieaufbau, der eine Temperatur- und/oder CO₂ -Regulierung ermöglicht⁷. Bei dieser Art von Versuchsaufbau wird jeweils eine experimentelle Wiederholung durchgeführt. Zusätzlich zur experimentellen Wiederholung verschiedener Behandlungen sollte berücksichtigt werden, dass die meisten Experimente ihre technischen Replikate haben sollten (bei denen mehr als eine Position pro Platte abgebildet wird), wobei eine Reihe von Fokusebenen (z-Stapeln) in einer Reihe von Zeitpunkten aufgezeichnet wird. So ergibt ein Versuchsdesign mit drei Wiederholungen einer Kontrolle und zwei Behandlungen, mit fünf Bildgebungspositionen pro Platte und 15 Zeitpunkten, 225 zu bearbeitende Stacks. Klassischerweise wurden Videos von lebenden Mitochondrien analysiert, indem Kymographen geplottet wurden, die einzeln analysiert wurden⁸, in einem zeitaufwändigen Prozess, der umfangreiche manuelle Eingaben erforderte, selbst wenn man sich auf Computertools stützte.

Kürzlich wurde ein Algorithmus beschrieben⁹ , der eine automatisierte Segmentierung und Verfolgung von Mitochondrien in lebenden 2D- und 3D-Zeitrafferdateien ermöglicht. Es gibt andere Quantifizierungstechniken, die alle ihre Grenzen haben¹⁰. Mitometer, eine automatisierte Open-Source-Anwendung, eignet sich besonders für Zeitraffer- und Mitochondriendynamikanalysen, die nur geringe Benutzereingaben erfordern. Diese Anwendung hat eine Reihe von Vorteilen gegenüber anderen bestehenden MATLAB-basierten Werkzeugen, nämlich die automatische Verarbeitung einzelner TIF-Stacks unter Verwendung von bis zu 13 verschiedenen Parametern, was besonders für die Neurowissenschaften interessant ist, da sie zwischen peri- und telenukleären Mitochondrien unterscheidet.

Bei einem Experiment wie dem oben beschriebenen ergeben diese 13 Parameter, die auf 225 Stapel angewendet werden, jedoch 2.925 einzelne Ausgabedateien. Diese erfordern vier einzelne Computereingaben, was sich auf über 10.000 manuelle Eingaben summiert, die zum Herunterladen aller Ausgabedateien erforderlich sind. Bei großen Versuchsdesigns führt dies zu einer unnötig extrem zeitaufwändigen Analyse jeder Datei und Datenintegration. Hier stellen wir eine Routineoptimierung vor, die eine schnelle Dateianalyse ermöglicht, das Lesen und die Datenverarbeitung von Dokumenten erheblich reduziert und Daten auf definierte Weise analysiert, die mit der Ausgabe bestehender Tools übereinstimmt.