고처리량 글라이칸 분석을 위한 마이크로어레이 폴리머 프로파일링(MAPP)

MAPP 방법의 주요 실험 단계는 그림 1에 요약되어 있습니다. 1. 샘플 준비 참고: 여기서, 이 방법은 예시 목적으로 식물 조직에 적용된다. 선택된 식물은 Coffea arabica, Allium sativum var. ophioscorodon 및 여러 태국 망고 품종 (Aokrong, Kam, Rad, Chokanan, Mamkamdang, Talabnak, Mahachanok 및 Nga)이었습니다. 식물은 상업적 중요성을 위해 선택되었습니다. 인간이 소비하기 위한 가공은 현재 충분히 활용되지 않는 농업 산업 폐기물을 생성하며, 이는 순수 글리칸을 포함한 부가가치 제품의 공급원을 제공할 수 있습니다. 따라서, MAPP는 바이오프로스펙팅 목적으로 폐기물 플랜트 바이오매스의 글리칸 조성을 특성화하기 위해 적용되었다. 식물 재료를 다른 조직(예: 뿌리, 줄기 및 잎)으로 분리합니다. 식물 조직을 40°C의 열풍 오븐에서 12-24시간 동안 건조시킵니다(샘플에 따라 시간 감소/증가). 또는 샘플을 액체 질소에 스냅 얼린 후 ~4일 동안 동결건조합니다. 각 튜브에 볼 베어링이 있는 유봉과 모르타르 또는 기계 조직 용해기( 재료 표 참조)를 사용하여 샘플을 미세한 분말로 균질화합니다.알림: 신선한 식물 조직의 경우 균질화 전에 건조 또는 동결 건조하는 것이 좋습니다. 일반적으로 유봉과 모르타르를 사용한 균질화는 대부분의 건조 샘플에 충분합니다. 곡물, 콩류 및 파스타와 같은 가공 식품과 같이 특히 탄력적인 시료의 경우 액체 질소에서 급속 냉동하면 시료 균질화의 속도와 효율성을 높일 수 있습니다. 기계적 균질화는 거의 모든 시료 유형과 호환되고, 훨씬 더 빠르고 노동 집약적이며, 동일한 장비(예: 유봉 및 모르타르)의 반복적인 사용으로 인한 시료 교차 오염 위험을 효과적으로 최소화한다는 것을 발견했습니다. 2. 알코올 불용성 잔류물(AIR)의 제조 70%(v/v) 에탄올 1.5mL를 50-100mg의 공기 건조 및 균질화된 시료 물질에 첨가합니다. 와류를 완전히 혼합한 후 실온에서 10분 동안 10,000 x g 으로 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 생성된 상층액을 버리고 펠릿을 보관합니다. 나머지 펠릿에 1.5mL의 메탄올과 클로로포름(1:1 [v/v])을 추가합니다. 2.2 단계에 따라 와류, 원심 분리 및 상층액을 폐기합니다. 나머지 펠릿에 1.5mL의 100% 아세톤을 추가합니다. 2.2 단계에 따라 와류, 원심 분리 및 상층액을 폐기합니다. 생성된 펠릿을 흄 후드에 밤새 넣어 잔류 아세톤이 증발하도록 하거나 건조될 때까지 진공 원심분리기에 넣습니다.알림: AIR 재료는 필요할 때까지 주변 온도에서 보관할 수 있습니다. 3. 글라이칸 추출 알림: 가능하면 재부유를 돕기 위해 각 튜브에 볼 베어링이 있는 조직 용해기에서 모든 추출 단계를 수행하십시오. 조직 용해기를 사용할 수 없는 경우 연속 교반 또는 진탕으로 대신 추출을 수행할 수 있습니다. 이것이 가능하지 않은 경우 추출 시간을 연장해야 할 수도 있습니다. 10mg의 AIR 물질에 pH 7.5의 50mM 시클로헥산디아민테트라아세트산(CDTA, 재료 표 참조) 30μL/mg을 추가합니다. 27Hz에서 2분 동안 흔든 다음 10Hz에서 2시간 동안 흔듭니다. 10,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 생성된 상층액을 유지하고 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 첨가한 다음 회전식 셰이커에서 4°C에 보관합니다. 잔류 펠릿에 30 μL/mg 4 M NaOH + 0.1 % (w/v) NaBH4를 첨가합니다.주의: NaBH4 는 삼키면 독성이 있습니다. 개인 보호 장비(PPE)를 사용하십시오. 흄 후드 아래에서 다루십시오. 먼지가 생기지 않도록 하십시오. 먼지를 흡입하지 마십시오. 제품이 물에 닿지 않도록 하세요. 3.2단계부터 3.3단계까지 반복합니다. 잔류 펠릿을 dH2O로 2-3 회 세척하여 잔류 NaOH를 제거한다. 펠릿에 30μL/mg 셀룰라아제(바람직하게는 GH5 엔도-1,4-β-글루카나아제, 제조업체에서 권장하는 적절한 효소 완충액, 재료 표 참조)를 펠릿에 첨가하고 효소 최적 온도에서 16시간 동안 배양합니다. 샘플을 10,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 유지하고 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브로 옮긴 다음 회전식 셰이커에서 4°C에서 보관합니다. 추출된 샘플은 가능한 한 빨리 인쇄해야 합니다. 저장된 모든 추출물을 다시 10,000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.알림: 샘플에는 미립자와 이물질이 없어야 합니다. 필요한 경우 마이크로어레이 인쇄 전에 0.2μm 스핀 필터를 통과시킵니다. 특히 점성이 있는 샘플은 마이크로어레이 모세관과 프린트 헤드가 쉽게 막힐 수 있기 때문에 마이크로어레이 분석과 호환되지 않습니다. 일반적으로 사용자는 표준 저용량 피펫으로 인쇄하려는 모든 샘플을 피펫팅할 수 있어야 합니다. 4. 표준의 준비 멸균 dH2O에서 정의된 글라이칸 표준물질(표 1)의 1mg/mL 용액을 준비합니다. 파키만을 표준으로 사용하는 경우 대신 4M NaOH에 용해시키고 가용화 후 빙초산으로 중화합니다. 준비된 표준물질을 회전식 쉐이커에서 4°C에서 하룻밤 동안 보관하여 완전히 용해되도록 합니다. 모든 표준물질을 4°C에서 10,000 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 파편을 펠릿화합니다. 결과 상층액은 후속 인쇄에 사용됩니다. 5. 마이크로어레이 인쇄 글리세롤 시스템 완충액(GSB, 47% 글리세롤, 52.9% dH2O, 0.06% Triton X-100 및 0.04% 살생물제[물에 0.15%-0.17% 질산구리 및 1.4%-2.0% 질산마그네슘 혼합] 및 필터 멸균)에 검은색 인도 잉크/드로잉 잉크의 1:20(v/v) 희석액을 준비하고 15,000 x g(실온)에서 10분 동안 원심분리합니다.참고: 잉크 용액은 인쇄된 샘플의 주위에 상단과 하단 테두리를 만들어야 인쇄된 마이크로어레이가 멤브레인에서 육안으로 감지될 수 있습니다. 그러나 잉크 용액에는 침전물이 포함될 수 있습니다. 모든 용액에는 인쇄를 위한 미립자가 없어야 하므로 피펫팅 시 침전물을 건드리지 마십시오. 이것이 더 이상 가능하지 않으면 버리고 새로 준비하십시오. 이 용액은 미립자를 제거하기 위해 쉽게 여과할 수 없습니다. 40μL의 잉크 용액과 GSB를 첫 번째 384웰 플레이트의 첫 번째 섹션에 추가합니다(그림 2). 모든 희석 1(D1) 웰에 25μL의 GSB를 추가합니다. 모든 희석 2, 3 및 4(D2-D4) 웰에 40μL의 GSB를 추가합니다. 추출된 글라이칸 시료 25μL를 D1 웰에 순서대로 추가하여 추출된 글라이칸 시료와 정의된 글라이칸 기질을 GSB로 1:1(v/v)로 희석합니다. D1 웰에서 샘플의 10μL를 채취하고 D2 웰에 추가하여 각 샘플을 4번 순차적으로 희석합니다. 피펫으로 부드럽게 흡인하여 혼합합니다. D2 웰에서 10μL의 샘플을 채취하여 D3 웰에 추가하여 프로세스를 반복합니다. D4 웰에 대해 반복합니다. 혼합 후 D4 웰에서 10μL를 버리면 각 웰에 최종 부피가 40μL가 포함됩니다. 40μL의 잉크 용액과 GSB를 최종 플레이트의 최종 블록에 추가합니다. 접착판 덮개로 플레이트를 덮고 3,000 x g (실온)에서 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 기포가 남아 있지 않은지 확인하고 필요한 경우 반복합니다. 비접촉식 압전 마이크로어레이 인쇄 로봇을 사용하여 아래 단계에 따라 샘플을 니트로셀룰로오스 멤브레인( 재료 표 참조)에 인쇄합니다.참고: 다음은 최적의 인쇄 품질을 위해 권장되는 작업입니다. 그러나 필요한 특정 매개변수는 궁극적으로 사용되는 기기에 따라 다릅니다. 사용자는 기기 제조업체에 문의하여 장치에 필요한 적절한 사용자 정의 및 인쇄 설정에 대해 논의하는 것이 좋습니다.인쇄하기 전에 폐기물 버퍼 저장소를 비우고 필요에 따라 깨끗한 버퍼 저장소에 깨끗한 GSB를 채웁니다. 기기를 켜고 습도 및 온도 제어 시스템이 통합된 경우 >10분 동안 안정화되도록 합니다. 마이크로어레이를 켜고 시스템을 초기화합니다.알림: 기기의 내부 압력을 결정하기 위해 테스트를 실행하는 것이 좋습니다. 압력이 너무 낮으면 고압 퍼지를 수행해야 할 수 있습니다. 다시 말하지만, 기기 제조업체에 연락하여 특정 기기의 특정 작동에 대해 논의하십시오. GSB로 프린트 헤드와 모세관을 여러 번 퍼지하여 이물질과 잠재적 오염 물질을 제거합니다. GSB 플레이트만 로드하거나 로드된 플레이트의 샘플 흡인을 우회하여 깨끗한 버퍼 저장소에서 직접 인쇄하도록 기기를 설정하여 테스트 인쇄를 수행합니다.알림: 니트로셀룰로오스 멤브레인을 사용하여 테스트 인쇄를 수행할 필요는 없습니다. 깨끗한 현미경 슬라이드로 충분하며 샘플 인쇄 전에 스폿 크기, 모양 및 품질을 육안으로 평가할 수 있다는 장점이 있습니다. 추출된 글라이칸 샘플을 인쇄할 때 각 샘플 사이에 깨끗한 GSB로 플러시하도록 시스템을 프로그래밍합니다.참고: 일반적으로 인쇄된 스폿당 시료 부피는 100pL – 10nL이며, 스폿 크기는 선택한 시료 부피에 따라 20μm에서 100μm 사이입니다. 하나의 소스 384웰 플레이트에서 100개의 마이크로어레이를 인쇄하는 데 시스템 플러싱을 포함하여 약 40분이 걸립니다. 결과 마이크로 어레이의 크기는 약 1cm2 입니다. 플레이트를 추가하면 어레이의 길이가 플레이트당 약 1cm 늘어납니다. 인쇄된 마이크로어레이 설계의 개략도는 그림 3에 나와 있습니다. 일단 인쇄되면, 마이크로어레이는 즉시 사용할 준비가 되어 있으며 몇 년 동안 보관할 수 있습니다. 어떤 이유로든 인쇄 작업을 반복해야 하는 경우, 인쇄 중 샘플이 증발할 가능성이 있으므로 새 샘플 플레이트를 로드하고 원래 플레이트를 폐기하는 것이 좋습니다. 일주일에 한 번 프린트 헤드와 모세관을 철저히 청소하십시오. GSB에 농축된 NaOH를 1:20 희석한 384웰을 로드하고 현미경 슬라이드에 40분에서 1시간 동안 인쇄하여 이 작업을 수행합니다. 사용자는 계속하기 전에 이 세척 용액이 기기와 호환되는지 확인해야 합니다. 다운스트림 분석을 위해 인쇄된 마이크로어레이용으로 생성된 고유한 그리드 파일(.gal 파일)을 저장합니다. 6. 마이크로어레이 프로빙 니트로셀룰로오스 멤브레인에서 개별적으로 동일한 인쇄된 마이크로어레이를 잘라내어 프로빙을 위해 적절한 크기의 용기(예: 12웰 또는 24웰 마이크로타이터 플레이트)에 넣습니다( 재료 표 참조). 어레이는 용기 바닥에 평평하게 놓여야 합니다. 프로브 당 하나의 마이크로 어레이가 필요하며 하나의 기술 복제를 나타냅니다. 비특이적 결합을 줄이려면 MP-TBST 차단 완충액(1x Tris-완충 식염수, pH 7.5, + 0.1% [v/v] TWEEN 20 [TBST]에서 마이크로어레이를 1시간 동안 배양하고 회전/로킹 셰이커에서 5% [w/v] 탈지유 분말, 재료 표 참조)을 보충합니다. 볼륨이 전체 어레이를 잠글 수 있을 만큼 충분한지 확인합니다. 배양 후 MP-TBST를 제거하고 새로운 용량의 MP-TBST로 교체합니다. MP-TBST에서 1:10-1:1,000(제조업체 지정, 재료 표 참조)으로 1:10-1:1,000(제조업체 지정, 재료 표 참조)을 회전/로킹 셰이커에서 2시간 동안 희석한 단클론 항체(mAb) 또는 His-태그 CBM 또는 기타 GRMP(예: 렉틴)로 어레이를 배양합니다. 배양 후 분자 프로브 용액을 제거하고 깨끗한 TBST로 어레이를 덮어 어레이가 완전히 잠기도록 합니다. 잔류 프로브 용액을 제거하려면 즉시 TBST를 제거하고 새 볼륨으로 교체하십시오. 어레이를 회전/흔들리는 셰이커에 5분 동안 놓습니다. 5분 후 TBST를 제거하고 새 볼륨으로 교체한 다음 회전/흔들리는 셰이커에 5분 동안 놓습니다.알림: 이 프로세스는 TBST의 초기 추가 및 즉시 제거를 제외하고 세 번 반복해야 합니다. MP-TBST에서 1:1,000으로 1:1,000으로 희석한 알칼리-인산가수분해효소 접합 2차 항체(적절한 경우 항-마우스, 항-쥐, 항-토끼, 항-His, 적절한 경우, 재료 표 참조)로 어레이를 배양합니다.참고: 양 고추냉이 과산화효소 접합 2차 항체도 적합하며, 발색을 위해 테트라메틸 벤지딘(TMB)/과산화수소 기질과 함께 사용됩니다. 배양 후 6.5단계에 따라 세척 절차를 반복하여 비특이적으로 결합된 2차 항체를 제거합니다. 항체 결합의 발색 검출을 위해 니트로 블루 테트라졸륨(NBT)/5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트(BCIP) 발색 용액( 재료 표 참조)으로 어레이를 덮습니다. 항원 결합 부위에 보라색 침전물 반점이 생길 때까지 그대로 두십시오(일반적으로 5-30분, 그러나 반응이 빠르게 발생할 수 있으므로 과포화를 피하기 위해 어레이를 면밀히 모니터링해야 함).주의 : BCIP는 피부에 닿으면 유해하며 호흡기 자극을 유발할 수 있습니다. PPE를 사용하십시오. 먼지가 생기지 않도록 하십시오. 먼지를 흡입하지 마십시오. 반응을 종료하려면 어레이를 깨끗한 수돗물에 담그고 광범위하게 세척하십시오. 주위 온도에서 밤새 압지 사이에 어레이를 놓아 건조시킵니다. 명백한 결함이 있는 어레이는 폐기하고 이러한 경우 프로빙 프로토콜을 반복합니다(그림 4). 7. 분석 및 정량화 데스크탑 스캐너를 사용하여 2,400dpi(인치당 도트 수) 해상도로 개발된 어레이를 스캔합니다. 이미지를 TIFF 파일로 변환한 다음 네거티브로 변환합니다. 마이크로어레이 분석 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 고유한 .gal 그리드 파일을 각 마이크로어레이 이미지에 오버레이하여 각 항원 결합 부위에서 생성된 스폿의 색상 강도를 계산하고 로컬 배경을 뺍니다. 그리드 데이터를 .txt 파일로 내보냅니다. 그런 다음 분석을 위해 Excel 시트로 수동으로 가져올 수 있습니다. 먼저 각 시료 희석에 대해 스폿 강도를 평균화한 다음 포함된 생물학적 복제에 대해 스폿 강도를 평균화하여 각 시료에 대한 평균 스폿 신호 강도 값을 생성합니다. 가장 높은 평균 스폿 신호 강도에 값 100을 할당하고 그에 따라 나머지 데이터를 정규화합니다.참고: 정규화된 평균 스폿 신호 강도는 Excel33의 조건부 서식 함수를 사용하거나 R ggplot2 패키지40,41의 geom_tile 함수를 사용하여 상대 글리칸 에피토프 풍부도의 히트맵으로 표시할 수 있습니다.