用于高通量聚糖分析的微阵列聚合物分析 （MAPP）

图1总结了MAPP方法的主要实验阶段。 1. 样品的制备 注意：在这里，该方法应用于植物组织以用于说明目的。选择的植物是 阿拉比卡咖啡、 Allium sativum var. ophioscorodon和 几个泰国芒果品种（Aokrong、Kam、Rad、Chokanan、Mamkamdang、Talabnak、Mahachanok 和 Nga）。选择这些植物是因为它们具有商业重要性。它们供人类消费的加工会产生目前未充分利用的农工废物，这些废物可能提供增值产品的来源，包括纯聚糖。因此，MAPP被用于表征废弃植物生物质的聚糖组成，用于生物勘探目的。 将植物材料分离成不同的组织（例如，根、茎和叶）。 将植物组织在40°C的热风烘箱中干燥12-24小时（根据样品减少/增加时间）。或者，将样品在液氮中快速冷冻，然后冻干~4天。 使用杵和研钵或机械组织裂解器（见 材料表）将样品均质成细粉，每个管中都有一个滚珠轴承。注意：对于新鲜植物组织，建议在均质化前干燥或冻干。通常，对于大多数干燥样品，用研杵和研钵均质就足够了。对于特别有弹性的样品，如谷物、豆类和加工食品（如意大利面），液氮快速冷冻可以提高样品均质化的速度和效率。我们发现，机械均质化几乎与所有样品类型兼容，速度更快，劳动强度更低，并且有效地将重复使用相同设备（即研杵和研钵）导致样品交叉污染的风险降至最低。 2.醇不溶性残留物（AIR）的制备 将 1.5 mL 70% （v/v） 乙醇加入 50-100 mg 风干均质样品材料中。 彻底涡旋混合，然后在室温下以10,000× g 离心10分钟。使用移液管弃去所得上清液并保留沉淀。 向剩余的沉淀中加入 1.5 mL 甲醇和氯仿 （1：1 [v/v]）。涡旋，离心，并按照步骤2.2弃去上清液。 向剩余的沉淀中加入 1.5 mL 100% 丙酮。涡旋，离心，并按照步骤2.2弃去上清液。 将所得颗粒在通风橱中过夜，使残留的丙酮蒸发，或在真空离心机中直至干燥。注意： AIR 材料可以在环境温度下储存，直到需要为止。 3. 聚糖提取 注意：如果可能，在组织裂解器中执行所有提取步骤，每个管中都有一个滚珠轴承，以帮助重悬。如果没有组织裂解器，可以通过连续搅拌或摇晃来进行提取。如果无法延长提取时间，则可能需要延长提取时间。 向 10 mg AIR 材料中加入 30 μL/mg 50 mM 环己二胺四乙酸（CDTA;见 材料表），pH 7.5。 以 27 Hz 摇动 2 分钟，然后以 10 Hz 摇动 2 小时。 在4°C下以10,000× g 离心10分钟。 保留所得上清液，将其加入无菌微量离心管中，并将其储存在4°C的旋转振荡器上。 向残留沉淀中加入 30 μL/mg 4 M NaOH + 0.1 % （w/v） NaBH4。注意：NaBH4 如果吞咽是有毒的。使用个人防护装备 （PPE）。在通风橱下处理。避免灰尘形成。避免吸入灰尘。请勿让产品与水接触。 重复步骤 3.2 到 3.3。用 dH2O 洗涤残留的沉淀两到三次以除去残留的 NaOH。 向沉淀中加入30μL / mg纤维素酶（最好是GH5内切-1,4-β-葡聚糖酶，在适当的酶缓冲液中 – 按照制造商的建议;参见 材料表），并在酶最佳温度下孵育16小时。 将样品在4°C下以10,000× g 离心10分钟。保留上清液，转移到干净的微量离心管中，并在4°C下储存在旋转振荡器上。提取后，必须尽快打印样品。 在4°C下再次以10,000× g 离心所有储存的提取物10分钟。注意： 样品必须没有颗粒和碎屑。如有必要，在微阵列打印之前通过0.2μm自旋过滤器。特别是粘性样品与微阵列分析不兼容，因为微阵列仪毛细管和打印头很容易堵塞。作为一般规则，用户应该能够使用标准小容量移液器移液所有用于打印的样品。 4. 标准的制定 在无菌dH2O中制备1mg / mL定义聚糖标准品（表1）的溶液。如果使用pachyman作为标准品，则溶解在4M NaOH中，并在溶解后用冰醋酸中和。 将制备的标准品在4°C下在旋转振荡器上储存过夜，以使其完全溶解。 将所有标准品在4°C下以10,000× g 离心10分钟，以沉淀任何碎片。所得上清液用于后续打印。 5. 微阵列打印 在甘油系统缓冲液（GSB;混合47%甘油，52.9%dH2O，0.06%Triton X-100和0.04%杀菌剂[0.15%-0.17%硝酸铜和1.4%-2.0%硝酸镁水溶液]中制备1：20（v / v）稀释的黑色印度墨水/绘图墨水，并过滤灭菌）（参见 材料表）并在15,000× g （室温）下离心10分钟。注意：需要墨水溶液在打印样品周围创建顶部和底部边框，以便可以在膜上目视检测到打印的微阵列。但是，墨水溶液可能含有沉淀物。所有溶液必须不含颗粒才能打印，因此移液时应避免干扰沉淀物。当不再可能时，请丢弃并重新准备。该溶液不容易过滤以去除颗粒。 向第一个 384 孔板的第一部分加入 40 μL 墨水溶液和 GSB（图 2）。 向所有稀释 1 （D1） 孔中加入 25 μL GSB。向所有稀释的 2、3 和 4 （D2-D4） 孔中加入 40 μL GSB。 通过按顺序向 D1 孔中加入 25 μL 提取的聚糖样品，用 GSB 稀释提取的聚糖样品和确定的聚糖底物 1：1 （v/v）。 从 D1 孔中取出 10 μL 样品并加入 D2 孔中，连续稀释每个样品四次。用移液管轻轻吸出以混合。 重复该过程，从 D2 孔中取出 10 μL 样品并将其添加到 D3 孔中。 对 D4 重复上述步骤。混合后，从 D4 孔中取出 10 μL，使每个孔的最终体积为 40 μL。 将 40 μL 墨水溶液和 GSB 加入最终板的最终块中。 用粘性板盖盖住板，并在3,000× g （室温）下离心10分钟。确保离心后没有气泡残留，必要时重复。 使用非接触式压电微阵列打印机器人，按照以下步骤将样品打印到硝酸纤维素膜上（参见 材料表）。注意：以下是为获得最佳打印质量而建议的措施;然而，所需的具体参数最终将取决于所使用的仪器。我们建议用户联系仪器制造商，讨论其设备所需的适当自定义和打印设置。打印前，清空废液缓冲液储液槽，并根据需要用干净的 GSB 填充干净的缓冲液储液槽。打开仪器并使其稳定 >10 分钟（如果它具有集成的湿度和温度控制系统）。打开微阵列器并初始化系统。注意： 建议运行测试以确定仪器的内部压力。如果压力太低，则可能需要进行高压吹扫。再次，与仪器制造商联系，讨论特定仪器的具体操作。 用 GSB 吹扫打印头和毛细管数次，以去除碎屑和潜在污染物。通过单独加载 GSB 板或将仪器设置为直接从干净的缓冲液储液槽中打印来执行测试打印运行，绕过从加载的板中抽取样品。注意：没有必要使用硝酸纤维素膜进行测试打印;干净的显微镜载玻片就足够了，其优点是在样品打印之前可以目视评估光斑大小、形状和质量。 打印提取的聚糖样品时，对系统进行编程，使其在每个样品之间用干净的GSB冲洗。注：通常，每个打印斑点的样品体积为 100 pL 至 10 nL，斑点尺寸范围为 20 μm 至 100 μm，具体取决于所选的样品体积。从一个来源 384 孔板打印 100 个微阵列芯片大约需要 40 分钟，包括系统冲洗。所得微阵列的大小约为 1 cm2 。额外的板将使阵列的长度增加约1厘米。印刷微阵列芯片设计示意图如 图3所示。一旦打印出来，微阵列就可以立即使用，并且可以储存数年。如果由于印刷过程中样品的潜在蒸发而需要重复打印作业，建议装入新的样品板并丢弃原始板。 每周一次，彻底清洁打印头和毛细管。为此，在GSB中加载含有1：20稀释度的浓缩NaOH的384孔，并在显微镜载玻片上进行40分钟至1小时的打印运行。在继续操作之前，用户应确保此清洁溶液与他们的仪器兼容。 保存为打印微阵列芯片生成的唯一网格文件（.gal 文件），以备下游分析。 6. 微阵列探测 从硝酸纤维素膜上切下单个相同的打印微阵列，并将它们放入适当大小的容器中进行探测（例如，12孔或24孔微量滴定板）（参见 材料表）。阵列应平放在容器的底部。每个探针需要一个微阵列芯片，代表一个技术重复。 为了减少非特异性结合，在旋转/摇摆振荡器上，将微阵列在MP-TBST封闭缓冲液（1x Tris缓冲盐水，pH 7.5，+ 0.1%[v/v] TWEEN 20 [TBST]并补充有5%[w/v]脱脂奶粉;参见 材料表）中孵育1小时。确保卷足以淹没整个阵列。 孵育后，取出 MP-TBST 并用新体积的 MP-TBST 替换它。 将阵列与单克隆抗体（mAb）或His标记的CBM或其他GRMP（例如凝集素）一起在MP-TBST中孵育2小时，稀释1：10-1：1,000（由制造商指定;参见 材料表）。 孵育后，取出分子探针溶液并用干净的TBST覆盖阵列，确保阵列完全浸没。要去除残留的探针溶液，请立即取出 TBST 并更换新的体积。将阵列放在旋转/摇摆振荡器上 5 分钟。5 分钟后，取出 TBST，更换新的体积，然后放在旋转/摇摆的摇床上 5 分钟。注意：此过程应重复三次，不包括最初添加和立即删除 TBST。 将阵列与碱性磷酸酶偶联的二抗（抗小鼠，抗大鼠，抗兔，抗His，视情况而定;参见 材料表）在MP-TBST中1：1,000稀释2小时，在摇摆/旋转振荡器上孵育。注：辣根过氧化物酶偶联的二抗也适用，与四甲基联苯胺 （TMB）/过氧化氢底物联合使用以显色。 孵育后，按照步骤6.5重复洗涤程序，以除去非特异性结合的二抗。 在硝基蓝四唑（NBT）/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯（BCIP）显色溶液（参见 材料表）中覆盖阵列，用于抗体结合的显色检测。静置直至抗原结合位点出现紫色沉淀斑点（通常为5-30分钟，但应密切监测阵列以避免过饱和，因为反应可能迅速发生）。注意：BCIP与皮肤接触时是有害的，可能会引起呼吸道刺激。使用个人防护装备。避免灰尘形成。避免吸入灰尘。 要终止反应，请将阵列浸入干净的自来水中并大量清洗。 将吸墨纸之间的阵列在室温下放置过夜以干燥。 丢弃有明显缺陷的阵列，并在这种情况下重复探测协议（图4）。 7. 分析和量化 使用桌面扫描仪以 2,400 点/英寸 （dpi） 的分辨率扫描开发的阵列。将图像转换为 TIFF 文件，然后转换为底片。 使用微阵列分析软件（参见 材料表），将唯一的 .gal 网格文件叠加到每个微阵列图像上，以计算每个抗原结合位点产生的斑点的颜色强度并减去局部背景。 将格网数据导出为 .txt 文件。然后，可以手动将这些数据导入到 Excel 工作表中进行分析。 首先在每个样品稀释度上平均斑点强度，然后在包含的任何生物重复中平均斑点强度，从而为每个样品生成平均斑点信号强度值。 将值 100 分配给最高平均点信号强度，并相应地对其余数据进行归一化。注意：然后，可以使用 Excel33 中的条件格式函数或使用 R ggplot2 包40,41 中的 geom_tile 函数将归一化的平均点信号强度表示为相对聚糖表位丰度的热图。