명시야, 2차 고조파 생성(SHG) 이미징 방식과 함께 광대역 진동 합-주파수 생성(VSFG) 이미지를 얻기 위해 다중 모드의 빠른 초분광 이미징 프레임워크가 개발되었습니다. 적외선 주파수가 분자 진동과 공명하기 때문에 대칭 허용 샘플에 대한 미세한 구조 및 중경 형태 지식이 드러납니다.
2차 비선형 광학 신호인 VSFG(Vibrational Sum-Frequency Generation)는 전통적으로 ~100μm의 공간 분해능을 가진 분광학 기술로 계면에서 분자를 연구하는 데 사용되었습니다. 그러나 분광법은 샘플의 이질성에 민감하지 않습니다. 메조스코프적으로 이질적인 샘플을 연구하기 위해 우리는 다른 사람들과 함께 VSFG 분광법의 해상도 한계를 ~1μm 수준으로 낮추고 VSFG 현미경을 구성했습니다. 이 이미징 기술은 이미징을 통해 샘플 형태를 분석할 수 있을 뿐만 아니라 이미지의 모든 픽셀에서 광대역 VSFG 스펙트럼을 기록할 수 있습니다. 2차 비선형 광학 기술인 이 선택 규칙은 생물학, 재료 과학 및 생명 공학 등에서 흔히 볼 수 있는 비중심대칭 또는 키랄 자체 조립 구조를 시각화할 수 있습니다. 이 기사에서 청중은 고정되지 않은 샘플을 이미징할 수 있는 반전된 투과 설계를 안내합니다. 이 연구는 또한 VSFG 현미경이 신경망 함수 솔버와 결합하여 개별 자체 조립 시트의 화학 물질별 기하학적 정보를 해결할 수 있음을 보여줍니다. 마지막으로, 다양한 샘플의 명시야, SHG 및 VSFG 구성에서 얻은 이미지는 VSFG 이미징에서 드러나는 고유한 정보에 대해 간략하게 설명합니다.
2차 비선형 광학 기법1,2인 VSFG(Vibrational Sum-Frequency Generation)는 대칭 허용 시료 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20,21,22입니다. 전통적으로 VSFG는 VSFG 활성의 요구 사항인 반전 대칭이 없는 계면 시스템 8,9,10,11(즉, 기체-액체, 액체-액체, 기체-고체, 고체-액체)에 적용되었습니다. VSFG의 이러한 응용은 매몰된 계면(12,13), 계면(14,15,16,17,18)에서의 물 분자의 구성, 및 계면(19,20,21,22)에서의 화학 종의 풍부한 분자 세부 정보를 제공하였다.
VSFG는 계면에서 분자 종과 구성을 결정하는 데 강력했지만 반전 중심이 없는 물질의 분자 구조를 측정하는 데 있어 그 잠재력은 충족되지 않았습니다. 이는 부분적으로 재료가 화학적 환경, 조성 및 기하학적 배열에서 이질적일 수 있고 기존 VSFG 분광기는 약 100μm2의 넓은 조명 영역을 갖기 때문입니다. 따라서 기존의 VSFG 분광법은 일반적인 100μm2 조명 영역에서 샘플의 앙상블 평균 정보를 보고합니다. 이러한 앙상블 평균화는 방향이 반대되는 잘 정렬된 영역 간의 신호 상쇄 및 국소 이질성의 오특성화(mischaracterization)를 유발할 수 있다 15,20,23,24.
높은 개구수(NA), 색수차가 거의 없는 반사 기반 현미경 대물렌즈(Schwarzschild 및 Cassegrain 형상)의 발전으로 VSFG 실험에서 두 빔의 초점 크기를 100μm2에서 1-2μm2로, 경우에 따라 서브미크론25로 줄일 수 있습니다. 이러한 기술 발전을 포함하여 당사 그룹 및 기타 업체는 VSFG를 현미경 플랫폼 20,23,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36으로 개발했습니다. 최근에는 반전된 광학 레이아웃 및 광대역 검출 방식(37)을 구현하여 멀티모달 이미지(VSFG, 2차 고조파 생성(SHG) 및 명시야 광학)을 원활하게 수집할 수 있습니다. 멀티 모달리티 이미징을 통해 광학 이미징을 사용하여 샘플을 빠르게 검사하고, 다양한 유형의 이미지를 상호 연관시키고, 샘플 이미지에서 신호 위치를 찾을 수 있습니다. 무채색 조명 광학 장치와 펄스 레이저 광원 선택을 통해 이 광학 플랫폼을 사용하면 형광 현미경38 및 라만 현미경과 같은 추가 기술을 향후 원활하게 통합할 수 있습니다.
이 새로운 배열에서는 계층적 조직 및 분자 자체 조립체(MSA) 클래스와 같은 샘플이 연구되었습니다. 이러한 재료에는 콜라겐과 생체 모방이 포함되며, 화학 조성과 기하학적 구성은 재료의 궁극적인 기능에 중요합니다. VSFG는 2차 비선형 광 신호이기 때문에 분자간 거리 또는 비틀림 각도와 같은 분자간 배열39,40에 특히 민감하여 화학 조성과 분자 배열을 모두 밝히는 데 이상적인 도구입니다. 이 연구는 광학 파라메트릭 증폭기(OPA)를 펌핑하는 이테르븀 도핑된 캐비티 고체 레이저, 2차원 하전 결합 장치(CCD) 검출기(27)에 결합된 자체 제작 멀티모달 도립 현미경 및 모노크로메이터 주파수 분석기로 구성된 핵심 기기의 VSFG, SHG 및 명시야 양식에 대해 설명합니다. 단계별 구성 및 정렬 절차와 설정의 전체 부품 목록이 제공됩니다. 기본 분자 소단위가 일반적인 계면활성제인 소듐-도데실 설페이트(SDS) 분자 1개와 본원에서 SDS@2 β-CD로 알려진 β-사이클로덱스트린(β-CD) 분자 2개로 구성된 MSA에 대한 심층 분석도 VSFG가 조직 물질의 분자 특이적 기하학적 세부 사항을 밝힐 수 있는 방법을 보여주는 예로 제공됩니다. 또한 MSA의 화학적 특이적 기하학적 세부 사항은 신경망 함수 솔버 접근 방식으로 결정할 수 있음이 입증되었습니다.
가장 중요한 단계는 1.42에서 1.44까지입니다. 광학 공간 해상도를 위해 대물 렌즈를 잘 정렬하는 것이 중요합니다. 방출된 신호를 수집하고, 릴레이하고, 스캐닝 빔을 입구 슬릿에 선으로 투사하는 것도 중요합니다. 적절한 정렬은 최상의 해상도와 신호 대 잡음비를 보장합니다. SDS@2 β-CD 100μm x 100μm 시트와 같은 일반적인 샘플의 경우 신호 대 노이즈 비율이 높은 양호한 해상도 이미지(~1μm 해상도)…
The authors have nothing to disclose.
기기 개발은 Grant NSF CHE-1828666의 지원을 받습니다. ZW, JCW 및 WX는 미국 국립보건원(National Institutes of Health), 국립종합의학연구소(National Institute of General Medical Sciences), 보조금 1R35GM138092-01의 지원을 받습니다. BY는 중국과학원(CAS, 2021183)의 청년혁신추진협회의 지원을 받습니다.
1x Camera Por | Thorlabs | WFA4100 | connect a camera to a microscope or optical system |
25.0 mm Right-Angle Prism Mirror, Protected Gold | Thorlabs | MRA25-M01 | reflect light and produce retroreflection, redirecting light back along its original path |
3” Universal Post Holder-5 Pack | Thorlabs | UPH3-P5 | hold and support posts of various sizes and configurations |
30 mm to 60 mm Cage Plate, 4 mm Thick | Thorlabs | LCP4S | convert between a 30 mm cage system and a 60 mm cage system |
500 mm Tall Cerna Body with Epi Arm | Thorlabs | CEA1500 | provide the function of enabling top illumination techniques in microscopy |
60 mm Cage Mounted Ø50.0 mm Iris | Thorlabs | LCP50S | control the amount of light passing through an optical system |
60 mm Cage Mounting Bracket | Thorlabs | LCP01B | mount and position a 60 mm cage system in optical setups |
Air spaced Etalon | SLS Optics Ltd. | Customized | generate narrow-band 1030 nm light |
Cage Plate Mounting Bracket | Thorlabs | KCB2 | hold and adjust mirrors at a precise angle |
CCD | Andor Technologies | Newton | 2D CCD for frequency and spatial resolution |
Collinear Optical Parametric Amplifier | Light Conversion | Orpheus-One-HP | Tunable MID light generator |
Copper Chloride | Thermo Fischer Scientific | A16064.30 | Self-assembly component |
Customized Dichroic Mirror | Newport | Customized | selectively reflects or transmits light based on its wavelength or polarization |
Ext to M32 Int Adapter | Thorlabs | SM1A34 | provide compatibility and facilitating the connection between components with different thread types |
Infinity Corrected Refractive Objective | Zeiss | 420150-9900-000 | Refractive Objective |
Infinity Corrected Schwarzschild Objective | Pike Technologies Inc. | 891-0007 | Reflective objective |
Laser | Carbide, Light-Conversion | C18212 | Laser source |
M32x0.75 External to Internal RMS | Thorlabs | M32RMSS | adapt or convert the threading size or type of microscope objectives |
M32x0.75 External to M27x0.75 Internal Engraving | Thorlabs | M32M27S | adapt or convert the threading size or type of microscope objectives |
Manual Mid-Height Condenser Focus Module | Thorlabs | ZFM1030 | adjust the focus of an optical element |
Monochromator | Andor Technologies | Shamrock 500i | Provides frequency resolution for each line scan |
Motorized module with 1" Travel for Edge-Mounted Arms | Thorlabs | ZFM2020 | control the vertical positon of the imaging objective |
Nanopositioner | Mad City Labs Inc. | MMP3 | 3D sample stage |
Resonant Scanner | EOPC | SC-25 | 325Hz resonant beam scanner |
RGB Color CCD Camera | Thorlabs | DCU224C | Brightfield camera, discontinued but other cameras will work just as well |
RGB tube lens | Thorlabs | ITL200 | white light collection |
Right Angle Kinematic Breadboard | Thorlabs | OPX2400 | incorporate a sliding mechanism with two fixed positions |
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 30 mm | Thorlabs | KCB1 | hold and adjust mirrors at a precise angle |
Right Angle Kinematic Mirror Mount, 60 mm | Thorlabs | KCB2 | hold and adjust mirrors at a precise angle |
SM2, 60 mm Cage Arm for Cerna Focusing Stage | Thorlabs | CSA2100 | securely mount and position condensers |
Snap on Cage Cover for 60 mm Cage, 24 in Long, | Thorlabs | C60L24 | enclose and protect the components inside the cage |
Sodium dodecyl sulfate | Thermo Fischer Scientific | J63394.AK | Self-assembly component |
Three-Chnnale Controller and Knob Box for 1" Cerna Travel Stages | Thorlabs | MCM3001 | control ZFM2020 |
Tube lens | Thorlabs | LA1380-AB – N-BK7 | SFG signal collection |
Visible LED Set | Thorlabs | WFA1010 | provide illumination in imaging setup |
Whitelight Source | Thorlabs | WFA1010 | Whitelight illumination source for brightfield imaging |
WPH05M-1030 – Ø1/2" Zero-Order Half-Wave Plate, Ø1" Mount, 1030 nm | Thorlabs | WPH05M-1030 | alter the polarization state of light passing through it |
WPLQ05M-3500 – Ø1/2" Mounted Low-Order Quarter-Wave Plate, 3.5 µm | Thorlabs | WPLQ05M-3500 | alter the polarization state of light passing through it |
X axis Long Travel Steel Extended Contact Slide Stages | Optosigma | TSD-65122CUU | positioning stages that offer extended travel in the horizontal (X) direction |
XT95 4in Rail Carrier | Thorlabs | XT95RC4 | mount and position optical components |
X-Y Axis Translation Stage w/ 360 deg. Rotation | Thorlabs | XYR1 | precise movement and positioning of objects in two dimensions, along with the ability to rotate the platform |
XY(1/2") Linear Translator with Central SM1 Thru Hole | Thorlabs | XYT1 | provide precise movement and positioning in two dimensions |
Yb doped Solid State Laser | Light Conversion | CB3-40W | Seed laser |
β-Cyclodextrin | Thermo Fischer Scientific | J63161.22 | Self-assembly component |