توليد والتلاعب من العضويات المعوية الفئران
Özet
هنا ، نقدم بروتوكولا لتوليد عضويات معوية للفئران واستخدامها في العديد من التطبيقات النهائية. غالبا ما تكون الفئران نموذجا مفضلا قبل السريري ، ويملأ النظام العضوي المعوي القوي الحاجة إلى نظام في المختبر لمرافقة الدراسات في الجسم الحي .
Abstract
عند استخدام المواد العضوية لتقييم قرارات علم وظائف الأعضاء ومصير الخلية ، من المهم استخدام نموذج يلخص عن كثب في سياقات الجسم الحي . وفقا لذلك ، يتم استخدام المواد العضوية المشتقة من المريض لنمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية وفحص العلاج الشخصي. تستخدم عضويات الأمعاء في الفئران بشكل شائع لفهم جوانب كل من وظيفة الأمعاء / علم وظائف الأعضاء وديناميكيات الخلايا الجذعية / قرارات المصير. ومع ذلك ، في العديد من سياقات المرض ، غالبا ما تفضل الفئران على الفئران كنموذج بسبب تشابهها الفسيولوجي الأكبر مع البشر من حيث الفيزيولوجيا المرضية للمرض. كان نموذج الفئران محدودا بسبب نقص الأدوات الوراثية المتاحة في الجسم الحي ، وقد أثبتت الكائنات العضوية المعوية للفئران أنها هشة ويصعب استزراعها على المدى الطويل. هنا ، نبني على البروتوكولات المنشورة مسبقا لتوليد عضويات معوية للفئران بقوة من الاثني عشر والصائم. نحن نقدم لمحة عامة عن العديد من التطبيقات النهائية التي تستخدم عضويات معوية للفئران ، بما في ذلك مقايسات التورم الوظيفي ، وتلطيخ جبل كامل ، وتوليد أحاديات الطبقة المعوية 2D ، ونقل lentiviral . يوفر نموذج الفئران العضوي حلا عمليا لحاجة الحقل إلى نموذج في المختبر يحتفظ بالأهمية الفسيولوجية للبشر ، ويمكن التلاعب به وراثيا بسرعة ، ويمكن الحصول عليه بسهولة دون الحواجز التي ينطوي عليها شراء عضويات معوية بشرية.
Introduction
العمارة الظهارية المعوية الصغيرة البشرية والتكوين الخلوي معقدة ، مما يعكس وظائفها الفسيولوجية. يتمثل الدور الأساسي للأمعاء الدقيقة في امتصاص العناصر الغذائية من الطعام الذي يمر عبر تجويفها1. لتعظيم هذه الوظيفة ، يتم تنظيم سطح الأمعاء في نتوءات تشبه الأصابع تسمى الزغابات ، والتي تزيد من مساحة السطح الامتصاصية ، والغزوات الشبيهة بالكوب تسمى الخبايا ، والتي تضم الخلايا الجذعية وتعزلها. داخل الظهارة ، يتم إنشاء أنواع مختلفة من الخلايا الامتصاصية والإفرازية المتخصصة لأداء وظائف مميزة1. بسبب هذا التعقيد ، كان من الصعب نمذجة أنسجة مثل الأمعاء في خطوط الخلايا الخالدة عالية الممرات. ومع ذلك ، فإن دراسة الخلايا الجذعية ، وخاصة الخلايا الجذعية البالغة وآليات تمايزها ، سمحت بتطوير الثقافات العضوية المعوية 3D. أدى استخدام النماذج العضوية إلى تحويل المجال ، ويرجع ذلك جزئيا إلى تلخيصها لبعض المكونات المعمارية وعدم تجانس نوع الخلية الموجود في الأمعاء السليمة. يمكن زراعة الكائنات العضوية المعوية على المدى الطويل في المختبر بسبب الحفاظ على عدد الخلايا الجذعية النشطة2.
أصبحت الكائنات العضوية المعوية بسرعة نموذجا قابلا للتكيف لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية ، وفسيولوجيا الخلية ، والأمراض الوراثية ، والتغذية 3,4 ، بالإضافة إلى أداة لتطوير طرق جديدة لتوصيل الأدوية5. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام المواد العضوية المشتقة من المريض لنمذجة الأمراض ، واكتشاف الأدوية ، وفحص العلاج الشخصي ، من بين أمور أخرى6،7،8،9. ومع ذلك ، لا تزال الكائنات العضوية المعوية البشرية تمثل تحديات. إن توافر الأنسجة ، ومتطلبات موافقة مجلس المراجعة المؤسسية ، والقضايا الأخلاقية تحد من الاستخدام الواسع النطاق للعينات البشرية. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب الكائنات العضوية المعوية البشرية المتولدة من الخبايا المعوية شرطين متميزين للثقافة للحفاظ على الخلايا الجذعية غير المتمايزة أو للحث على تمايز أنواع الخلايا الناضجة10. هذا يتناقض مع الجسم الحي ، حيث توجد الخلايا الجذعية وأنواع الخلايا المتمايزة الناضجة في وقت واحد ويتم توليدها / صيانتها باستمرار1. من ناحية أخرى ، لا تتطلب الكائنات العضوية المعوية للفأر ، والتي تزرع في مزيج أقل تعقيدا من عوامل النمو ، هذا التبديل في تكوين الوسائط ويمكنها الحفاظ على الخلايا الجذعية والخلايا المتمايزة في نفس سياق الوسائط 2,11. ومع ذلك ، فإن الاختلافات الرئيسية في أمعاء الفأر عند مقارنتها بالبشر يمكن أن تجعل عضويات الفئران نموذجا دون المستوى الأمثل في كثير من الحالات. بشكل عام ، تم إنشاء العديد من الكائنات العضوية المعوية من الثدييات الكبيرة ، بما في ذلك الخيول والخنازير والأغنام والأبقار والكلاب والقطط ، بنجاح في ظروف الاستزراع الأكثر توافقا مع الكائنات العضوية المعوية للفأر من ظروف زراعة الكائنات العضوية المعوية البشرية12. من المحتمل أن تعكس الاختلافات في ظروف عامل النمو بين الفئران والكائنات العضوية البشرية الاختلافات في تكوين الخلايا الجذعية المتخصصة والمتطلبات المختلفة لبقاء الخلايا الجذعية وانتشارها وصيانتها. لذلك ، هناك حاجة إلى نظام عضوي نموذجي يسهل الوصول إليه 1) يشبه إلى حد كبير تكوين الخلايا المعوية البشرية ، 2) يحتوي على خلايا جذعية ذات متطلبات عامل النمو مثل تلك الخاصة بالكائنات العضوية المعوية البشرية ، و 3) قادر على الحفاظ باستمرار على مقصورات غير متمايزة ومتباينة. من الناحية المثالية ، سيكون النظام من نموذج حيواني قبل سريري شائع الاستخدام ، بحيث يمكن ربط التجارب في الجسم الحي وفي المختبر واستخدامها جنبا إلى جنب.
الفئران هي نموذج ما قبل السريري شائع الاستخدام لفسيولوجيا الأمعاء ودراسات علم الأدوية بسبب تشابهها الشديد في فسيولوجيا الأمعاء والكيمياء الحيوية للبشر13 ، خاصة فيما يتعلق بنفاذية الأمعاء14. حجمها الأكبر نسبيا مقارنة بالفئران يجعلها أكثر قابلية للعمليات الجراحية. في حين أن النماذج الحيوانية الكبيرة ، بما في ذلك الخنازير ، تستخدم في بعض الأحيان ، فإن الفئران هي نموذج أكثر بأسعار معقولة ، وتتطلب مساحة أقل للتربية ، ولديها سلالات قياسية متاحة تجاريابسهولة 15. عيب استخدام نماذج الفئران هو أن مجموعة الأدوات الجينية للدراسات في الجسم الحي ليست متطورة بشكل جيد مقارنة بالفئران ، وغالبا ما يكون توليد سلالات الفئران الجديدة ، بما في ذلك الضربة القاضية ، والضربات القاضية ، والجينات المحورة ، باهظ التكلفة. إن تطوير وتحسين نموذج عضوي قوي لأمعاء الفئران من شأنه أن يسمح بالتلاعب الجيني والعلاجات الدوائية ودراسات الإنتاجية الأعلى في نموذج يمكن الوصول إليه يحتفظ بالأهمية الفسيولوجية الرئيسية للبشر. ومع ذلك ، فإن مزايا نموذج عضوي للقوارض مقابل آخر تعتمد بشكل كبير على العملية أو الجين المعين قيد الدراسة. قد تكون بعض الجينات الموجودة في البشر جينات زائفة في الفئران ولكن ليس الفئران16,17. بالإضافة إلى ذلك ، يتم الكشف بشكل متزايد عن أنواع فرعية من الخلايا الخاصة بالأنواع بواسطة RNAseqأحادي الخلية 18،19،20. أخيرا ، غالبا ما تظهر نماذج الأمراض المعوية للفئران والفئران اختلافات كبيرة في الأنماط الظاهرية21,22 بحيث يجب اختيار النموذج الذي يلخص الأعراض وعملية المرض التي تظهر في البشر عن كثب للعمل النهائي. يوفر إنشاء نموذج عضوي معوي للفئران مرونة واختيارا إضافيا للباحثين في اختيار نظام نموذجي أكثر ملاءمة لظروفهم. هنا ، يتم توسيع البروتوكولات الحالية23،24 لتوليد عضويات معوية للفئران ويتم تحديد بروتوكول لتوليد وصيانة الكائنات العضوية المعوية للفئران من الاثني عشر أو الصائم. بالإضافة إلى ذلك ، تم وصف العديد من التطبيقات النهائية ، بما في ذلك العدوى الفيروسية العدسية ، وتلطيخ جبل كامل ، ومقايسات تورم فورسكولين.
Protocol
Representative Results
Discussion
يحافظ تطوير نموذج عضوي معوي للفئران على الخصائص الوظيفية المهمة الموجودة في العضو في الجسم الحي وهو أداة واعدة للاختبار قبل السريري وفحص الأدوية والمقايسات الوظيفية. يمكن استخدام هذا النموذج في المختبر بالتوازي مع دراسات أمراض الجهاز الهضمي قبل السريرية في الجسم الحي ، والتي غالبا ما تكون الفئران نموذجا مفضلا لها بسبب حجمها المعوي الأكبر ، والجوانب الفسيولوجية المشتركة مع البشر ، وفي بعض الحالات تكون نماذج مرض أفضل38. هنا ، تم تحديد بروتوكول قوي خطوة بخطوة لعزل الخبايا المعوية للفئران ، وتوليد وثقافة طويلة الأجل من عضويات معوية الفئران ، بالإضافة إلى تطبيقات المصب بما في ذلك فحوصات تورم فورسكولين الوظيفية ، وتألق مناعي كامل ، وثقافة أحادية الطبقة 2D ، والتلاعب الجيني للفيروسات العدسية. من المحتمل أن تكون العضويات المعوية للفئران ذات صلة في العديد من سياقات المرض حيث تكون الفيزيولوجيا المرضية لنماذج الفئران غير مناسبة وقد توفر نموذجا أفضل لفسيولوجيا الأمعاء البشرية مقارنة بالعضوية المعوية للفئران.
لإنشاء ثقافات عضوية طويلة العمر يمكن تمريرها وتوسيعها ، من الضروري تحديد عوامل النمو الرئيسية المطلوبة للحفاظ على الانتشار الظهاري المعوي. غالبا ما تزرع عضويات الفأر في كوكتيل بسيط من EGF و R-spondin و Noggin ، على الرغم من أنه تم الإبلاغ عن أن Noggin ليس ضروريا لثقافة الأعضاء المعوية39. يمكن أن تحل الوسائط المكيفة محل عوامل النمو المؤتلفة وخطوط الخلايا الأكثر استخداما هي L-WRN ، والتي تفرز Wnt3a و Rspondin-3 و Noggin39 و L-Wnt3a و HA-Rspondin1-Fc 293Tالخلايا 40. الوسائط المكيفة L-WRN كافية لدعم ليس فقط نمو الفئرانالمعوية 39 العضوية ، ولكن نمو الكائنات العضوية المعوية من العديد من المزرعة والحيوانات المصاحبة ، بما في ذلك الكلاب والقطط والدجاج والخيول والأبقار والأغنام والخنازير12. ومع ذلك ، فإن الكائنات العضوية المعوية البشرية تختلف اختلافا كبيرا في متطلبات عامل النمو ، لأنها تتطلب تركيبات وسائط متميزة لمرحلة نموها التوسعي (أي التقدم من كرويات صغيرة إلى كبيرة) مقابل مرحلة تمايزها (أي توليد ونضج أنواع الخلايا المتمايزة)10. تعكس المتطلبات الإعلامية للعضويات المعوية للفئران عن كثب تلك الخاصة بوسائط النمو التوسعية للعضويات المعوية البشرية ، ومع ذلك ، على وجه الخصوص ، فإن عضويات الفئران قادرة على النمو والتمايز في هذه البيئة الإعلامية ، مما يبسط إلى حد كبير متطلبات الاستزراع الخاصة بهم. بينما ركزت محاولاتنا الأولية على إنشاء وتنمية عضويات معوية للفئران في وسائط مكيفة L-WRN ، كانت الثقافة طويلة المدى ضعيفة ، وعانت خطوط الأعضاء المعوية في الفئران من نقص المتانة (البيانات غير معروضة). قد يكون هذا بسبب تصميم خطوط خلايا L-WRN لإفراز R-spondin 3 ، بينما تم تصميم خط الخلايا 293T-Rspo1 الموصى به هنا لإفراز R-spondin 1. من الممكن أن تفضل الفئران والكائنات العضوية البشرية R-spondin 1 ، مما قد يفسر فشل خطوط الفئران العضوية في الوسائط المشروطة L-WRN.
لتلخيص الإعداد في الجسم الحي عن كثب ، من المهم تطوير ظروف الثقافة العضوية التي تسمح ببقاء الخلايا الجذعية وصيانتها وتكاثرها ، والتي يمكن أن تحافظ على دوران الخلايا وأحداث التمايز المتزامنة إلى أنواع خلايا منفصلة. لذلك ، يجب معايرة تركيزات البروتينات و / أو البروتينات المؤتلفة في الوسائط المكيفة بإحكام والتحكم فيها لتحقيق هذا التوازن المثالي. على وجه الخصوص ، تعد مستويات Wnt المثلى ضرورية لتجنب فقدان الثقافات العضوية المعوية. القليل جدا من Wnt في الوسائط المكيفة لن يكون قادرا على دعم النمو ، مما يؤدي إلى فقدان الخلايا الجذعية والموت العضوي اللاحق ؛ سيؤدي الإفراط في تنشيط Wnt إلى أن تكون المواد العضوية كيسي وغير متمايزة10. على الرغم من عدم تفصيلها هنا ، يوصى بشدة باختبار كل دفعة من الوسائط المكيفة L-Wnt3a و 293T-Rspo1 باستخدام مقايسة لوسيفيراز مراسل Wnt ، مثل خط خلية Topflash41. وقد وصفت الدراسات السابقة أن الدفعة المثلى من وسائط L-Wnt3a يجب أن تؤدي إلى زيادة الإشارة بمقدار 15 ضعفا عند 12.5٪ وزيادة الإشارة بمقدار 300 ضعف عند 50٪ ، مقارنة ب 1٪ L-Wnt3a10. نظرا لأن عضويات الفئران أكثر حساسية من عضويات الفئران لمتطلبات الاستزراع ، وخاصة مستويات تنشيط Wnt ، فإن خطوات مراقبة الجودة الإضافية هذه تساعد بشكل كبير في تسهيل متانة وموثوقية مزارع الفئران العضوية. نظرا لعدم توفر خط مراسل مماثل لاختبار نشاط Bmp وتركيزات Noggin النسبية في وسائط Noggin المكيفة ، فمن المستحسن استخدام Noggin المؤتلف عندما يكون ذلك ممكنا للتحكم بدقة في مستويات Noggin. في حين يمكن زراعة العضويات المعوية للفأر والحفاظ عليها في غياب Noggin39 ، لم تتم محاولة ذلك لمزارع الأعضاء المعوية للفئران.
بالإضافة إلى متطلبات زراعة الخلايا ، يعتمد الإنشاء الأولي الناجح لخط عضوي للفئران بشكل حاسم على الاستنفاد الفعال للزغابات المتمايزة أثناء عزل السرداب. تتسبب المستويات العالية من تلوث فيلار في موت القبو ، ويفترض أنه إما بسبب إشارات من الخلايا المحتضرة أو عزل العوامل الأساسية. لاستنفاد هذه الزغابات المتمايزة من المستحضرات الظهارية بدقة وثبات ، يوصى بإجراء عزلات ظهارية بمساعدة مجسم. يوفر الفحص البصري للظهارة التي يتم إطلاقها إشارة واضحة عند التخلص من PBS واستبداله (الشكل 1). لا ينبغي جمع الخبايا حتى يكون هناك استنفاد كاف للزغب. يتم تمييز خلايا فيلار بشكل نهائي ولا يمكنها توليد عضويات في الثقافة. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب المرور اللاحق للعضويات المعوية للفئران واستخدامها لأي تطبيق نهائي رعاية دقيقة. تؤدي الحضانة في كواشف التفكك لفترات زمنية أطول (10 دقائق) إلى موت كبير للخلايا وفقدان الخط العضوي.
هنا ، يتم وصف بروتوكول بسيط وسريع لتوليد أحاديات الأمعاء من عضويات الفئران. ركائز EME والكولاجين I لها تأثيرات مختلفة على الظهارة ، والتي يمكن الاستفادة منها اعتمادا على الغرض من الدراسة. يسمح EME بالالتصاق السريع والفعال للخلايا المفردة وتشكيل نتوءات الخلايا. في المقابل ، فإن طلاء السطح بالكولاجين يؤخر هذه العمليات. بمجرد أن تصل الطبقة الأحادية إلى التقاء 80٪ تقريبا ، تبدأ الخلايا المزروعة على EME في توليد هياكل عضوية 3D مرة أخرى. ومع ذلك ، فإنها تفتقر إلى الدعم المادي والكيميائي الكافي لمواصلة النمو. يمكن منع هذا الارتداد إلى الحالة العضوية عن طريق الحفاظ على أحادي الطبقات في EME عند التقاء 50٪ -80٪. إن إضافة EME المخفف إلى السطح القمي للطبقات الأحادية يعزز الانتعاش السريع وتشكيل المواد العضوية دي نوفو ، مما يولد مناطق التقارب بسرعة وسهولة أكبر. على سطح الكولاجين الأول ، يمكن للخلايا أن تشكل طبقة أحادية موحدة وتولد مجموعات صغيرة. ومع ذلك ، فإن إضافة الكولاجين الأول فوق الطبقات الأحادية لا يكفي للحث على تكوين عضوي. يجب تخفيف EME عند الإضافة إلى سطح الطبقة الأحادية ، حيث ستكون هناك مقاومة ميكانيكية أقوى للتغلب على العضو الناشئ. ومع ذلك ، فإن هذا EME المخفف لا يسمح بتكوين قوي للعضويات الكبيرة. يجب إزالة أي عضويات فئران تم إنشاؤها من جديد تنفصل بشكل طبيعي عن السطح على الفور ونقلها إلى EME غير المخفف حتى يمكن استعادة الدعم الهيكلي والنمو. نظرا لصغر حجم المواد العضوية في هذه الخطوة ، لا ينصح بمرور المواد العضوية حتى يتم إنشاء نمو قوي. الأهمية البيولوجية الكامنة وراء سبب قدرة EME على دعم إصلاح المواد العضوية ، ولكن ما إذا كان الكولاجين يمكنني القيام بذلك أم لا ، ليس واضحا. ومع ذلك ، كانت هناك تقارير تفيد بأن الخلايا المزروعة في الكولاجين ثلاثي الأبعاد لا يمكنها تكوين عضويات ناشئة42,43 أو دعم الصيانة طويلة الأجل. منتجات EME المتاحة تجاريا هي مخاليط غير متجانسة من البروتينات خارج الخلية ، في المقام الأول اللامينين والكولاجين IV44. ومن ثم، فإن التركيب المميز للبروتينات وقدرة الخلية الطلائية على التعامل مع المصفوفة خارج الخلية باستخدام معقدات خلوية مختلفة يمكن أن يسمح بإعادة البناء في EME ولكن ليس الكولاجين الأول. لم يتم اختبار ما إذا كان يمكن وضع أحاديات الطبقات المشتقة من الكولاجين I في EME لدعم تكوين الأعضاء ونموها.
يتم وصف التلاعب الجيني لنموذج العضو العضوي المعوي للفئران هنا ، ويتم تحديد بروتوكولات نقل lentiviral من organoids 3D والنقل العابر للطبقات أحادية 2D. للتغلب على الكفاءة المنخفضة لنقل العضوي lentiviral ، تم تطوير بروتوكول للانتقال العابر للطبقات أحادية 2D. يوفر التشكل المسطح والمجالات القمية المكشوفة للطبقات الأحادية وصولا أسهل إلى الفيروسات والمجمعات المحتوية على الحمض النووي. تم استخدام تعبير مراسل EGFP باستخدام ناقل pLJM1-EGFP للتحقق من صحة هذه التقنية. لوحظ تعبير مراسل GFP بعد 24 ساعة ، وتم الحفاظ عليه لمدة 5-6 أيام في طبقة أحادية. من المرجح أن يكون للدراسات المستقبلية التي تركز على نقل الفيروسات العدسية للطبقات الأحادية كفاءة أعلى من نقل العضوي 3D. باستخدام البروتوكولات المذكورة أعلاه ، يمكن إصلاح المواد العضوية 3D من أحادي الطبقات 2D المصابة لتسهيل إنشاء خطوط مستقرة. بحذر ، يمكن الحفاظ على خطوط الكائنات العضوية المعوية للفئران بنجاح لأكثر من عام ، وتبقى مستقرة على مدار العديد من الممرات ، وحفظها بالتبريد ، وإذابتها بنجاح ، وتعديلها وراثيا باستخدام نقل الفيروسات العدسية ، وبالتالي تلبية الحاجة إلى نموذج عضوي معوي يمكن الوصول إليه وقابل للتتبع في المختبر يحتفظ بالأهمية الفسيولوجية للبشر.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء مختبري سوميغراي وأمين على مناقشاتهم المدروسة. تم دعم هذا العمل من خلال منحة مؤسسة تشارلز إتش هود لصحة الطفل ومنحة مؤسسة التليف الكيسي (004741P222) إلى KS والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى التابع للمعاهد الوطنية للصحة إلى NA بموجب الجائزة رقم 2R01DK077065-12.
Materials
| 3-D Culture Matrix Rat Collagen I | Cultrex/R&D Systems | 3447-020-01 | |
| 70 µm cell strainer | Corning/Falcon | 352350 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco/Thermo Fisher | 12634010 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | |
| CryoStor | Stem Cell Technologies | 100-1061 | |
| Cultrex HA-Rspondin1-Fc 293T cells | R & D Systems | 3710-001-01 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes/Thermo Fisher | D1306 | |
| FBS | Gibco/Thermo Fisher | 16-000-044 | |
| Gastrin I (human) | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 100-0485 | |
| Glutamax | Thermo Fisher | 35-050-061 | |
| Growth factor-reduced Matrigel, phenol red-free | Corning | 356231 | |
| HEPES | AmericanBio | AB06021 | |
| Lanolin | Beantown Chemical | 144255-250G | |
| L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher | A2916801 | |
| L-Wnt3a cells | ATCC | CRL-2647 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher | 17502-048 | |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco/Thermo Fisher | 31985070 | |
| Paraffin | Fisher Scientific | P31-500 | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P7793 | transparent film |
| PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Thermo Fisher | 15140122 | |
| pLJM1-EGFP | Addgene | 19319 | |
| Polybrene | Millipore | TR-1003-G | |
| Polyethylenimine hydrochloride (PEI) | Sigma Aldrich | 764965 | |
| p-phenylenediamine | Acros Organics/Thermo Fisher | 417481000 | |
| Puromycin | VWR | J593-25mg | |
| Recombinant human FGF2 protein | Peprotech | 100-18B-250ug | |
| Recombinant human IGF-1 protein | Biolegend | B356441 | |
| Recombinant human Noggin protein | R & D Systems | 6057-NG-100 | |
| Recombinant mouse EGF protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Sprague Dawley rat | Charles River Laboratories | Strain 001 | |
| Triton X-100 | American Bioanalytical | AB02025-00500 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco/Thermo Fisher | 12604013 | |
| Y27632 dihydrochloride | Sigma Aldrich | Y0503 |
Referanslar
- Beumer, J., Clevers, H. Cell fate specification and differentiation in the adult mammalian intestine. Nature Reviews. Molecular Cell BiologyI. 22 (1), 39-53 (2021).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Yin, Y. -. B., de Jonge, H. R., Wu, X., Yin, Y. -. L. Enteroids for nutritional studies. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (16), 1801143 (2019).
- Cai, T., et al. Effects of six common dietary nutrients on murine intestinal organoid growth. PLoS One. 13 (2), e0191517 (2018).
- Davoudi, Z., et al. Gut Organoid as a new platform to study alginate and chitosan mediated PLGA nanoparticles for drug delivery. Marine Drugs. 19 (5), 282 (2021).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yin, Y. B., de Jonge, H. R., Wu, X., Yin, Y. L. Mini-gut: a promising model for drug development. Drug Discovery Today. 24 (9), 1784-1794 (2019).
- Zietek, T., et al. Organoids to study intestinal nutrient transport, drug uptake and metabolism – update to the human model and expansion of applications. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 577656 (2020).
- Gunther, C., Winner, B., Neurath, M. F., Stappenbeck, T. S. Organoids in gastrointestinal diseases: from experimental models to clinical translation. Gut. 71 (9), 1892-1908 (2022).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
- Zhao, Z., et al. Organoids. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94 (2022).
- Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
- Fagerholm, U., Johansson, M., Lennernas, H. Comparison between permeability coefficients in rat and human jejunum. Pharmaceutical Research. 13 (9), 1336-1342 (1996).
- Dubbelboer, I. R., Dahlgren, D., Sjogren, E., Lennernas, H. Rat intestinal drug permeability: A status report and summary of repeated determinations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 364-376 (2019).
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Zhang, Z., Carriero, N., Gerstein, M. Comparative analysis of processed pseudogenes in the mouse and human genomes. Trends in Genetics. 20 (2), 62-67 (2004).
- Lambracht-Washington, D., Fischer Lindahl, K. Active MHC class Ib genes in rat are pseudogenes in the mouse. Immunogenetics. 56 (2), 118-121 (2004).
- Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819 (2021).
- Burclaff, J., et al. A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (5), 1554-1589 (2022).
- Haber, A. L., et al. A single-cell survey of the small intestinal epithelium. Nature. 551 (7680), 333-339 (2017).
- Olivier, A. K., Gibson-Corley, K. N., Meyerholz, D. K. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of cystic fibrosis: gastrointestinal, pancreatic, and hepatobiliary disease and pathophysiology. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (6), G459-G471 (2015).
- Lu, P., et al. Animal models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of necrotizing enterocolitis: pathophysiology, translational relevance, and challenges. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (11), G917-G928 (2014).
- Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).
- Hedrich, W. D., et al. Development and characterization of rat duodenal organoids for ADME and toxicology applications. Toxicology. 446, 152614 (2020).
- How to Cryopreserve Intestinal Organoids. STEMCELL Available from: https://www.stemcell.com/technical-resources/area-of-interest/organoid-research/intestinal-research/tech-tips-protocols/how-to-cryopreserve-intestinal-organoids.html (2023)
- How to Thaw Intestinal Organoids. STEMCELL Available from: https://www.stemcell.com/technical-resources/educational-materials/protocols/how-to-thaw-intestinal-organoids.html (2023)
- Sancak, Y., et al. The Rag GTPases bind raptor and mediate amino acid signaling to mTORC1. Science. 320 (5882), 1496-1501 (2008).
- Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L., Montenegro-Miranda, P. S., Vanden Brink, G. R., Heijmans, J. A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (98), e52531 (2015).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: an in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
- Regent, F., et al. Nicotinamide promotes formation of retinal organoids from human pluripotent stem cells via enhanced neural cell fate commitment. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 878351 (2022).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Breau, K. A., et al. Efficient transgenesis and homology-directed gene targeting in monolayers of primary human small intestinal and colonic epithelial stem cells. Stem Cell Reports. 17 (6), 1493-1506 (2022).
- Berkers, G., et al. Rectal organoids enable personalized treatment of cystic fibrosis. Cell Reports. 26 (7), 1701-1708 (2019).
- deWinter-de Groot, K. M., et al. Forskolin-induced swelling of intestinal organoids correlates with disease severity in adults with cystic fibrosis and homozygous F508del mutations. Journal of Cystic Fibrosis. 19 (4), 614-619 (2020).
- Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- van Mourik, P., Beekman, J. M., vander Ent, C. K. Intestinal organoids to model cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 54 (1), 1802379 (2019).
- Tong, T., et al. Transport of artificial virus-like nanocarriers through intestinal monolayers via microfold cells. Nanoscale. 12 (30), 16339-16347 (2020).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nature Medicine. 15 (6), 701-706 (2009).
- Xu, Q., et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and Frizzled-4, a high-affinity ligand-receptor pair. Cell. 116 (6), 883-895 (2004).
- Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9 (9), e107814 (2014).
- Sachs, N., Tsukamoto, Y., Kujala, P., Peters, P. J., Clevers, H. Intestinal epithelial organoids fuse to form self-organizing tubes in floating collagen gels. Development. 144 (6), 1107-1112 (2017).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).
