大肠杆菌长期进化实验中的每日转移、存档种群和测量适应性

1. LTEE人群的每日转移 注意：每天通过用前一天烧瓶中的1%培养物接种新鲜培养基来转移12个LTEE群体。 图 1 总结了此过程中的步骤。从菌株REL606开始的六个Ara− 群体被指定为A−1至A−6，从菌株REL607开始的六个Ara+ 群体被指定为A+1至A+6。严格遵守无菌技术以及转移人口的时间表和顺序，可将污染和其他中断的风险降至最低。 用 70% 乙醇或 10% 漂白剂溶液擦拭 LTEE 转移的表面，对进行 LTEE 转移的表面进行消毒。点燃本生燃烧器以产生局部上升气流并使玻璃器皿燃烧。注意：戴上实验室手套以防止污染。为了明火周围的安全，仅使用由不易燃的丁腈等材料制成的手套至关重要。 准备 13 个 50 mL 硼硅酸盐锥形瓶，瓶盖 20 mL 硼硅酸盐或聚丙烯烧杯，这些烧杯已通过高压灭菌进行洗涤和灭菌。检查烧瓶是否有可见的碎屑，并更换任何不完全干净的烧瓶。 使用红色标记标记六个烧瓶 A−1 至 A−6，使用黑色标记标记其他六个烧瓶 A+1 至 A+6。标记最后一个剩余的烧瓶，该烧瓶为空白，日期为月/日格式和星期几。 使用无菌 10 mL 血清移液管向 13 个烧瓶中的每一个填充 9.9 mL DM25 培养基。取下用作盖子的烧杯后和更换烧杯之前，点燃每个烧瓶的口。在填充每个烧瓶之间点燃移液器的尖端。注意：制作 DM25 的说明可在线获取30。如果使用塑料血清移液器，请放弃燃烧其尖端或限制在火焰中的时间，以避免塑料熔化。 从振荡培养箱中取出前一天的LTEE烧瓶。 通过将每个烧瓶举到灯光下来检查每个烧瓶以评估其浊度和颜色，检查烧瓶的完整性，并寻找异物的存在。注意：肉眼可见，与空白相比，所有 Ara− 和 Ara+ 培养物看起来都会略微浑浊，但 A−3 除外，由于培养基中柠檬酸盐的生长，其浑浊度将比其他培养物多 ~10 倍。许多外部微生物污染物也能够在柠檬酸盐上生长，因此A−3以外的人群中浊度增加可能表明污染。有关转移前LTEE培养物的图像，请参阅 代表性结果 部分。 可选：通过将 1 mL 空白和 1 mL 每种培养物移液到 1 cm 塑料比色皿中，并在消隐仪器后使用分光光度计获取 600 nm （OD 600） 的光密度读数，确认每种 LTEE 培养物具有预期的浊度。注意：对于刚开始使用LTEE并且不确定通过肉眼判断浊度以及记录和调查可疑异常的研究人员，这个额外的步骤非常有用。只有在完成当天的正常转移到新烧瓶（以下步骤）后，才从前一天的烧瓶中取样以测量OD 600，以最大程度地降低污染将继续繁殖的细胞群的风险如果OD 600值符合预期。有关LTEE培养物的典型OD600值，请参阅 代表性结果 部分。 使用带有无菌过滤器吸头的 P200 微量移液器，将每个 LTEE 烧瓶中的 100 μL 培养物转移到含有新鲜 DM25 的相应烧瓶中。从 A−1 开始，然后转移 A+1。之后，继续在 − 和 + 种群之间交替。为了跟踪哪些培养物被转移，在从烧瓶移液或移液到烧瓶后，将烧瓶向左移动。注意：Ara− 和Ara+ 种群之间的严格转移和交替顺序有助于防止和检测交叉污染和混淆。遵守严格的无菌技术：每次转移使用新鲜的移液器吸头，在开盖后和重新盖上盖之前立即点燃烧瓶口，并在每次转移之间用 70% 乙醇润湿的无绒纸擦拭微量移液器的桶和喷射器。切勿使用漂白剂对微量移液器进行消毒，因为即使是微量也会杀死培养物。 将新接种的烧瓶在37°C下孵育24±1小时，以120rpm的轨道振荡在1英寸直径上。 将前一天的培养物储存在4°C。 将这些备份区域性保留两天。丢弃三天前在4°C下保存的旧培养物。注意：前两天的培养物提供了两套完整的备份，如有必要，如果发生任何问题或事故，或者在转移之前发现前一天培养物的污染（例如，奇怪的颜色或意外的颗粒），则可以重新启动实验。 在转移日志笔记本中输入时间、日期、转移编号、进行转移的研究人员的姓名或首字母缩写、培养物是否正常以及任何其他相关信息。如果发生以下任何一种情况，请继续执行步骤 1.12-1.14：（1） 前一天的空白被污染，（2） 烧瓶或其盖子破裂或破裂，（3） 烧瓶含有异物，（4） 烧瓶在转移过程中翻倒或掉落，或 （5） 有任何其他事件或观察结果使继续使用这些烧瓶值得怀疑。 如果前一天的LTEE培养物有任何问题，事故或怀疑污染，请不要从中转移。相反，将整套十二种培养物储存在4°C，以供以后检查和进一步表征。 检索含有从前一天转移并储存在4°C的备份培养物的烧瓶。 将它们放在工作台上加热至室温。轻轻旋转每个烧瓶以重悬细胞。 从备用烧瓶转移到含有新鲜培养基的新烧瓶中，并按照步骤1.6-1.11中的描述正常继续实验。在传输日志中记下使用了备份区域性，并记录与前一天相同的传输编号。注意：即使仅在一个群体的烧瓶中发现问题，也要从备用烧瓶中转移所有十二个种群，以便所有种群中经过的世代数保持相位。如果在储存在4°C的备用烧瓶中发现污染，则必须使用步骤3.1-3.2中描述的程序从冷冻种群中重新启动受影响的LTEE群体。LTEE的转移数不应增加，直到复兴后DM25中第一批培养物的生长。 2. 存档 LTEE 种群 注意：LTEE群体的样本每75次转移一次冷冻一次。在100倍转移稀释后，种群每天增长~6 2/3代，因此这一时期对应于~500代。在存档过程中，还将LTEE群体接种在不同类型的琼脂培养基上以检查污染。或者，可以从这些板中挑选代表性克隆并存档。 图 1 总结了这些步骤。 在计划冷冻的前一天或前几天，准备三种类型的琼脂平板：最小葡萄糖（MG），最小阿拉伯糖（MA）和阿拉伯糖四唑铵（TA）。每种类型的琼脂制作十二个盘子，外加一些额外的。同时准备至少 250 mL 的 0.85% （w/v） 无菌盐水和 50 mL 的 80% （v/v） 无菌甘油。注意：所有介质和溶液的配方均可在线获取30.LTEE达到常规存档时间表的倍数500的前一天是自上次冻结以来的第74天加上 由于检测到或怀疑问题时从4°C备份烧瓶转移而增加的任何天数。 可选：如果从LTEE群体中存档克隆分离株，请准备额外的耗材：从每个群体中分离三个克隆需要72 MG板，80 mL 80%（v / v）甘油和370 mL DM1000。 在计划冻结的前一天执行每日LTEE转移的步骤1.2时，准备一组额外的十二个烧瓶。使用红色标记标记六个额外的烧瓶xA−1至xA-6，并使用黑色标记标记其他六个xA + 1至xA + 6。注意：“x”表示额外的烧瓶集将用于存档，并将它们与另一组烧瓶区分开来，后者将用于并行继续LTEE的日常传输。 在执行每日LTEE转移的步骤1.4时，使用25 mL血清移液管用14.85 mL DM25填充每个额外的烧瓶。 按照步骤 1.5−1.11 中所述完成正常的 LTEE 传输。然后，重复步骤 1.8 的说明，但这次将前一天的每个 LTEE 培养物中的 150 μL 转移到将用于存档的 14.85 mL 新鲜 DM25 的额外烧瓶中。注意：在此步骤和所有后续步骤中，请遵循这些准则避免污染和混淆。从总体 A−1 开始，然后转移 A+1，然后继续交替使用 − 和 + 种群。切换群体时，用蘸有 70% 乙醇的无绒纸擦拭微量移液器的桶和喷射器。移液后，将烧瓶和试管移入托盘或架子中，以跟踪已完成的转移。 将十二个烧瓶的一组孵育在37°C下存档24±1小时，120rpm轨道振荡，直径为1英寸，与步骤1.9中所述的十二个LTEE培养物和空白一起。 在冻结当天进行LTEE转移之前至少一小时准备电镀LTEE群体的用品。选择12个MG，12个MA和12个TA琼脂平板。目视检查每个，以确保它没有任何明显的污染。 为十二个LTEE群体（A−1至A + 6）中的每个标示每种类型的板之一。注意：标记板时，写在培养皿底部的侧面。这对于当人们想要从琼脂下方检查或拍摄它们时不遮挡菌落很重要。不要在盖子上写字，因为它们可能会混淆。 将琼脂平板置于37°C培养箱中至少20分钟以加热它们，然后再在步骤2.10中使用它们。 准备24个含有9.9毫升盐水的试管。将它们排列在十二组中，每组两管。 以与平板相同的方式标记两组十二个试管中的每一个，在LTEE群体标识符下方添加“1”或“2”，以指定它们用于稀释该群体的顺序。 使用烧瓶执行步骤1.1-1.11，该烧瓶将像往常一样继续LTEE的日常转移。在步骤1.5中，还从振荡培养箱中取出含有额外培养物的十二个烧瓶以进行存档。 从 12 个附加烧瓶中的每一个移取 100 μL 培养物，以存档到该 LTEE 群体的第一对盐水试管中。用这些100倍稀释液彻底涡旋管。然后，从每个管中移取 100 μL 到相应的第二管盐水中。彻底涡旋最终的10，000倍培养稀释液。 从含有 10，000 倍培养稀释液的每个试管中吸取 80 μL，到该群体的标记 TA、MG 和 MA 板中。根据需要，使用无菌扩散棒或无菌扩散珠将液体均匀地散布在琼脂表面上。重复直到所有十二个群体都接种在所有三种类型的培养基上。 如有必要，让板干燥，直到琼脂上看不到液体。将平板倒置（琼脂面朝上）置于设置为37°C的重力对流培养箱中。注意：倒置孵育板可防止琼脂变干，并防止冷凝物滴落到琼脂表面。在孵育过程中，液体中细胞在琼脂表面上的移动可能会涂片菌落并产生不正确的菌落计数。 将 3 mL 无菌 80% （v/v） 甘油添加到指定用于存档的 12 个额外烧瓶中。通过旋转和轻轻涡旋充分混合。 将每个烧瓶中的混合物分配到无菌冷冻管中，这些冷冻管已标记有样品的唯一标识符，样品所属的LTEE群体，冷冻的世代，它是混合（群体）样品以及日期。将 6 mL 移液到一个大瓶中，将 1.25 mL 移液到六个小瓶中。注意：大瓶是工作原料。一个小瓶是备用的，以防工作库存耗尽或被污染。其他五个小瓶是可以发送到其他实验室的副本。 将填充的小瓶在-80°C冷冻。 孵育24小时和48小时后检查并记录TA，MG和MA平板上菌落的生长和形态。注意：有关REL606和REL607祖先以及12个LTEE种群中的每一个在76，000代时形成的菌落的图像和描述，请参阅 代表性结果 部分。 可选：存档克隆分离物时，请执行以下步骤。从MG平板中为每个LTEE群体挑选三个克隆分离株（集落），在新的MG板上分别划线，并在37°C下将这些平板孵育16-24小时。注意：如果存在具有不同形态的菌落，LTEE 的标准做法是通过首先选择最常见的类型，然后从少数类型中选择更多菌落来采样以获得最大的多样性。还可以使用随机采样策略，在展开细胞之前在培养皿底部的底部标记点，然后在生长后选择离每个标记最近的分离菌落。 第二天，在新的MG板上划线每个板的代表性菌落，并在37°C下孵育这些板16-24小时。 第二天，将每个MG板中的一个分离菌落接种到含有10mL新鲜DM1000的烧瓶中。此外，用 10 mL DM1000 填充一个额外的烧瓶，作为未接种的空白以测试培养基污染。 将烧瓶在37°C孵育16-24小时，120rpm轨道振荡，直径为1英寸。 孵育后，向每个烧瓶中加入 2 mL 无菌 80% （v/v） 甘油并旋转混合。 将每个烧瓶中的 1.25 mL 等分试样分配到小的无菌小瓶中，标有每个克隆、其 LTEE 群体和起源生成、克隆样品和日期的唯一标识符。 将填充的小瓶在-80°C冷冻。 3. 竞争性健身检测 注意：在LTEE中，生殖适应性是根据不同细菌在与每日转移相同的条件下在一个或多个24小时培养周期中实现的相对倍增数来量化的。具体来说，一个竞争对手与另一个竞争对手的相对适应度是他们在共同文化中正面竞争时实现的倍增率的比率。一对中的每个竞争对手可能是一个完整的群体，也可能是以前作为LTEE冷冻“化石记录”的一部分存档的克隆分离株。或者，一个或两个竞争对手可能是经过基因改造以添加或删除特定突变以测试其效果的克隆。两个竞争者必须具有相反的Ara+/Ara− 状态，因为该遗传标记用于在此测定过程中区分它们。竞争分析的总体工作流程如图 2所示。共培养阶段的持续时间可以从一天延长到三天（或更长时间），以提高在测试几乎均匀匹配的竞争对手之间的差异时适应性估计的精度。有关此协议的其他关键注意事项和可能的修改，请参阅 讨论 。 图 2：竞争测定流程图。 显示了为期一天的竞赛测定的完整程序。为期三天的程序在第1天和第2天继续使用替代途径，直到第3天以与一天比赛第1天相同的方式进行电镀。请点击此处查看此图的大图。 准备用品确定将使用多少个竞争对手LTEE菌株和/或群体，以及将为每对竞争对手进行多少重复竞争测定。按照以下步骤中所述准备必要的用品。注意：所有介质和溶液的配方均可在线获取30.比赛实验所有日子所需的烧瓶和试管可以事先填充，也可以在使用当天根据需要填充。如果提前填充烧瓶和试管，请将它们储存在室温下避光，以尽量减少蒸发。TA板需要至少在使用前两天准备，以便在倒入后足够干燥，以便进行培养稀释。始终准备一些额外的烧瓶、试管和 TA 板，以便在出现移液错误、污染板或其他小事故时可以继续实验。 对于复兴日（第 −2 天），用 20 mL 烧杯填充一个无菌 50 mL 锥形瓶，每株或 大肠杆菌 群体中加入 9.9 mL DM1000 或溶原肉汤 （LB），将用作竞争对手。用 9.9 mL 的相同培养基再填充一个烧瓶，作为未接种的空白。 对于预处理日（Day −1），每个竞争者用9.9 mL的0.85%（w / v）无菌盐水填充一个试管，在一对竞争者之间每次重复测定用9.9mL DM 25填充两个烧瓶，以及另一个装有9.9 mL DM 25的烧瓶用于空白。 在比赛开始的当天（第 0 天），用 9.9 mL DM25 填充一个烧瓶，用 9.9 mL 的 0.85% （w/v） 无菌盐水填充一个试管，每个比赛测定重复准备一个 TA 板。再用 9.9 mL DM25 填充一个烧瓶作为空白。 替代方案：对于超过第一天的多天比赛的每一天，每次比赛重复用 9.9 mL DM25 填充一个烧瓶，并用 9.9 mL DM25 再填充一个烧瓶以获得空白。 在比赛的最后一天（例如， 第 1 天或第 3 天），用 9.9 mL 的 0.85% （w/v） 无菌盐水填充两个试管，并为每个比赛重复准备一个 TA 板。 第 −2 天：在 DM1000 或 LB 中分别复活竞争对手对于每个竞争对手，标记一个装满 9.9 mL DM1000 或 LB 的烧瓶。 标记一个装满来自同一批培养基的 9.9 mL 的额外烧瓶，作为未接种的空白以测试污染。注意：冷冻原液在LB或DM1000中复活，以便更均匀和可预测地恢复冷冻保存的细胞。用作冷冻保护剂的甘油可以被 大肠杆菌代谢，如果在DM25中复活样品，这将导致细胞密度高于预期。LB和DM1000支持生长到如此高的细胞密度，以至于这种并发症可以忽略不计。 将含有竞争对手菌株冷冻原液的冷冻管从-80°C冰箱中取出。使用时将小瓶放在冰桶中冷藏。 每个冷冻原液解冻后，彻底涡旋以重悬 大肠杆菌 细胞。如果复活克隆，则用 12 μL 冷冻原液接种含有新鲜培养基的烧瓶。如果使种群复活，则用120μL冷冻原液接种烧瓶。注意：将120μL体积的冷冻原液用于群体，因此当1%的LTEE群体转移到新烧瓶中时，复活的细胞数量与每日瓶颈大致相同。多次解冻和涡旋冷冻种群会给细胞带来压力，并随着时间的推移降低种群的生存能力。如果给定的LTEE种群或克隆将在比赛中多次使用，则最好重新生长和冷冻多个拷贝的种群，这样就不会多次解冻和重新冷冻单个拷贝。 将复活瓶和空白在37°C孵育过夜（16-24小时），以120rpm的轨道振荡1英寸直径。 Day −1：在DM25中单独预条件竞争对手对于每个参赛者，标记装有 9.9 mL 盐水的试管。对于一对竞争者之间的每次重复竞争测定，标记两个装满 9.9 mL DM25 的 50 mL 烧瓶，每个烧瓶都有重复编号和其中一个竞争者的名称。标记一个装满 9.9 mL DM25 的额外烧瓶作为空白。 将装有复活竞争对手培养物的烧瓶从培养箱中取出。用肉眼检查它们的浑浊度，以确认它们生长并且没有明显的污染。 从每个烧瓶中吸取 100 μL 到该竞争对手的生理盐水试管中。注意：此步骤将培养物稀释100倍，这是必要的，因为LB和DM1000中的细胞密度远高于LTEE中使用的DM25环境（参见 代表性结果）。 在将稀释培养物中的 100 μL 移液到装有新鲜 DM25 的烧瓶中之前，彻底涡旋每个稀释管。为每个重复测定接种两个这些预处理瓶，每个竞争对手一个。 将预处理瓶和空白在37°C孵育24±1小时，以120rpm的轨道振荡在1英寸直径上。 第 0 天：通过混合竞争对手和盘子进行初始计数来开始比赛对于每个竞赛测定重复，标记一个装有 9.9 mL DM25 的烧瓶和一个装有 9.9 mL 盐水的试管。以唯一标识每对竞争对手和竞争测定的重复编号的方式标记烧瓶和试管。标记一个装满 9.9 mL DM25 的额外烧瓶作为空白。 将预处理瓶从培养箱中取出。用肉眼检查它们的浑浊度，以确认它们生长并且没有明显的污染。 将 50 μL 的 Ara− 竞争物转移到装满新鲜 DM25 的第一个重复竞赛烧瓶中。立即将 50 μL Ara+ 竞争物转移到同一竞赛瓶中，并通过轻轻旋转进行混合。 对所有竞争对手对的所有重复重复步骤3.4.3。注意：竞赛烧瓶现在具有在DM25中生长的大 肠杆菌 培养物的总体100倍稀释度，与LTEE中细胞在每次每日转移后经历的条件相同。执行传输和混合的顺序很重要。立即将两个竞争对手一个接一个地添加到每个烧瓶中，这样两者都不会在新鲜培养基中领先一步。例如，不要将 Ara− 培养物添加到所有竞赛培养瓶中，然后返回并添加所有 Ara+ 菌株。 从每个新接种的竞赛烧瓶中吸取 100 μL 到标记为该竞争测定重复的盐水试管中，以便这些试管中的每一个都含有合并的预处理 DM25 培养物的总体 10，000 倍稀释度。 将竞赛烧瓶和空白放入振荡培养箱中。将竞争烧瓶在37°C孵育24±1小时，120rpm轨道振荡直径为1英寸。 同一天，将竞赛烧瓶放入培养箱后，立即彻底涡旋步骤3.4.5中的每个试管，并按照步骤2.10所述将这些10，000倍稀释液的80μL散布在TA板上。用混合的一对菌株、重复编号和“第 0 天”标记每个板底部的侧面，以指示它将用于确定每个竞争对手的初始表示。 将TA板倒置在37°C的重力对流培养箱中孵育，直到Ara− 和Ara+ 竞争对手的菌落可见且可区分。一般来说，这发生在16-24小时内，但对于一些进化的菌株可能需要更长的时间。计算每个平板上Ara− （红色）和Ara+ （白色）菌落的数量并记录结果。注意：即使将板储存在4°C下，TA板上Ara- 和Ara+ 菌落的颜色之间的差异也会随着时间的推移变得不那么明显，因此一旦从培养箱中取出，也需要尽快对其进行计数。显示由Ara− 和Ara+ 细胞形成的菌落的典型外观的TA板图像包含在 代表性结果中。该部分还包含常见“边缘情况”菌落的图像（例如，不同菌落类型的重叠或生长），并解释了如何计算它们。如果先前未表征任何竞争者在TA平板上形成的菌落的生长速率和形态，则在第0天从预处理瓶中散布80μL的10，000倍稀释盐水中，当竞争物仍然彼此分离时。然后，在37°C孵育16-24小时或更长时间后检查这些对照板上的菌落。 备选方案：第1天和第2天：继续为期三天的比赛对于每个竞争测定重复，标记一个装有 9.9 mL DM 25 的烧瓶。以唯一标识每对竞争者、重复编号和竞争测定日期的方式标记烧瓶。标记一个装满 9.9 mL DM25 的额外烧瓶作为空白。 将前一天的竞赛瓶从培养箱中取出。用肉眼检查它们的浊度，以验证预期的生长并检测污染。 将每个竞赛烧瓶中的 100 μL 转移到相应的新鲜培养基烧瓶中，用于比赛的第二天。 将新的竞赛烧瓶和空白放入振荡培养箱中。将它们在37°C下孵育24±1小时，以120rpm的轨道振荡在1英寸直径上。 在比赛的第2天重复步骤3.5.1-3.5.4，然后再继续。 第 1 天或第 3 天：完成比赛并盘子进行最终计数对于每个竞赛瓶，准备两个装有 9.9 mL 盐水的试管。以唯一标识每对竞争物、重复编号以及它们是用于第一次稀释还是第二次稀释的方式标记它们。 将竞赛烧瓶从培养箱中取出。用肉眼检查它们的浑浊度，以检测它们是否生长并且没有明显的污染。 从每个竞赛烧瓶中吸取 100 μL 到第一管生理盐水中进行重复。所得试管含有 100 倍稀释的 DM25 培养物。 涡旋每个 100 倍稀释管以使其充分混合，并将 100 μL 移液到第二管盐水中以进行重复。所得试管含有 10，000 倍稀释的 DM25 培养物。 彻底涡旋每个含有 10，000 倍稀释液的试管，并将其 80 μL 铺在 TA 板上，如步骤 2.10 中所述。用混合的一对菌株、重复编号标记每个板底部的侧面，为期一天的比赛为“第 1 天”，为期三天的比赛为“第 3 天”，以表明它将用于确定每个竞争对手的最终代表。 将TA板在37°C孵育，并计数生长后的Ara−和Ara+ 菌落，如步骤3.4.8中所述。注意：在所有转移和电镀步骤中跟踪每个竞争测定的重复次数。混淆不同重复测定之间的最终计数和初始计数 – 即使相同的两个竞争对手在每一个中混合 – 将导致不正确的适应性估计。 计算和绘图适合度如果使用 Excel 计算和绘制相对适应度，请下载 XLS 电子表格（补充文件 1）。如果使用 R，请安装 fitnessR 包31 并下载逗号分隔值 （CSV） 模板（补充文件 2），或按照其小插图中的说明生成此文件的新副本。 输入100的“转印稀释度”，用于在下载文件中的指定细胞或列中进行的竞赛测定。输入参赛者共培养的每日生长周期总数作为“转移次数”（例如，为期三天的比赛为 3）。 在指定的单元格或列中输入每对竞争者的名称，参考菌株为“竞争对手1”，测试菌株或群体为“竞争对手2”。 对于每个竞争测定重复，将相应的初始和最终菌落计数输入到下载文件的指定列中。 如果使用 Excel 电子表格，它现在将显示此估计值的平均相对适应度值和 95% 置信限。将不同竞争对手组合的结果复制到另一个工作表中，并创建一个汇总结果的图表。如果使用 R 分析数据，请按照 fitnessR 包的小插图中的说明执行这些计算，输出包含计算值的 CSV 文件，然后绘制结果。