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Özet
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Genetik

希少細胞集団におけるプロモーター中心の時空間ゲノム構造を研究するための統合ワークフロー

Published: April 21, 2023
doi:
10.3791/65316
, , , ,
1Josep Carreras Leukaemia Research Institute, 2Barcelona Supercomputing Center, 3Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), 4Institute for Health Science Research Germans Trias i Pujol

Özet

遺伝子発現は、遺伝子プロモーターと遠位調節要素との相互作用によって調節される。ここでは、低入力のCapture Hi-C(liCHi-C)により、以前は測定できなかった希少細胞型におけるこれらの相互作用の同定がどのように可能になるかを説明します。

Abstract

時空間的な遺伝子転写は、転写を制御するために標的遺伝子プロモーターとの物理的な近接に依存するエンハンサーやサイレンサーなどの遠位調節要素によって厳密に制御されています。これらの調節要素は同定が容易ですが、それらのほとんどは細胞型特異的であり、線形ゲノム配列において数百キロ塩基離れている可能性があり、他の非標的遺伝子をスキップするため、それらの標的遺伝子を予測することは困難です。数年前から、プロモーターキャプチャーHi-C(PCHi-C)は、遠位調節エレメントを標的遺伝子に関連付けるためのゴールドスタンダードでした。しかし、PCHi-Cは数百万の細胞の入手可能性に依存しており、初代組織から一般的に得られるような希少細胞集団の研究を禁止しています。この制限を克服するために、ゲノムの各遺伝子を制御する遠位調節要素のレパートリーを同定するための費用効果が高くカスタマイズ可能な方法である低入力Capture Hi-C(liCHi-C)が開発されました。liCHi-Cは、PCHi-Cと同様の実験および計算フレームワークに依存していますが、チューブの変更を最小限に抑え、試薬の濃度と量を変更し、ステップを交換または排除することにより、ライブラリ構築中の材料損失を最小限に抑えます。liCHi-Cは、発生生物学と細胞機能の文脈における遺伝子制御と時空間ゲノム構成の研究を可能にします。

Introduction

時間的な遺伝子発現は細胞の分化を促進し、最終的には生物の発生を促進し、その変化は幅広い疾患と密接に関連しています1,2,3,4,5。遺伝子転写は、近位(すなわち、遺伝子プロモーター)および遠位(例えば、エンハンサーまたはサイレンサー)に分類され得る調節要素の作用によって細かく制御され、後者はしばしば標的遺伝子から遠くに位置し、クロマチンループを介してそれらと物理的に相互作用して遺伝子発現を調節する6,7,8。

ゲノム中の遠位調節領域の同定は、これらの領域が特異的なヒストン修飾9,10,11を有し、特異的な転写因子認識モチーフを含み、それらの募集プラットフォームとして機能するため、広く合意されている問題である12,13,14。その上、エンハンサーおよびスーパーエンハンサー15,16の場合、それらはまた低ヌクレオソーム占有率17,18を有し、ノンコーディングeRNA19,20に転写される。

それにもかかわらず、各遠位調節要素の標的遺伝子を予測することはより困難です。多くの場合、遠位調節要素とその標的との間の相互作用は、細胞型および刺激特異的であり21,22、数百キロベースに及び、任意の方向に他の遺伝子を橋渡しし23,24,25、標的遺伝子または他の非介在遺伝子のイントロン領域内に位置し得る26,27.さらに、遠位調節要素は同時に複数の遺伝子を制御することもでき、逆もまた同様である28,29。この位置の複雑さは、それらの間の調節関連を特定することを妨げ、したがって、すべての細胞型における各調節要素の標的のほとんどは未知のままです。

近年、クロマチン相互作用を研究するための染色体立体構造捕捉(3C)技術の開発に大きなブームがありました。それらの中で最も広く使用されているHi-Cは、細胞のゲノム30のすべての断片間のすべての相互作用のマップを生成することを可能にする。しかし、制限断片レベルで有意な相互作用を検出するために、Hi-Cは超深部シーケンシングに依存しており、個々の遺伝子の調節状況を日常的に研究するためにそれを使用することを禁止しています。この経済的限界を克服するために、ChIA-PET 31、HiChIP32、およびその低入力対応物HiCuT33など、いくつかの濃縮ベースの3C技術が登場しました。これらの技術は、特定のタンパク質によって媒介されるゲノム全体の相互作用を濃縮するための抗体の使用に依存しています。それにもかかわらず、これらの3C技術のユニークな特徴は、それらのアプリケーションの悩みの種でもあります。ユーザーは、目的のタンパク質に対する高品質の抗体の入手可能性を頼りにしており、タンパク質の結合が動的である条件を比較することはできません。

プロモーター捕捉Hi−C(PCHi−C)は、これらの制限を回避する別の濃縮ベースの3C技術である34、35。PCHi-Cは、ビオチン化RNAプローブ濃縮システムを採用することにより、28,650個のヒトまたは27,595個のマウスアノテーション付き遺伝子プロモーター(プロモーターインタラクトームとも呼ばれる)と相互作用するゲノム領域のゲノムワイドな高解像度ライブラリを生成することができます。このアプローチにより、活性プロモーターと非活性プロモーターの両方の制限フラグメントレベルの分解能で有意な長距離相互作用を検出し、ヒストン修飾やタンパク質結合のダイナミクスとは無関係に、任意の条件間でプロモーター相互作用を堅牢に比較することができます。PCHi-Cは、細胞分化中のプロモーターの相互作用体再編成を同定するために近年広く使用されており36,37、転写因子の作用機序を同定し38,39、非コード変異体40,41,42,43,44,45によって疾患において調節解除される新しい潜在的な遺伝子および経路を発見する。46、47、48、新しいドライバ非コード変異49、50と並んで。さらに、捕捉システムを変更するだけで、この手法を生物学的問題に従ってカスタマイズして、任意のインタラクトーム(例えば、エンハンサーインタラクトーム51または非コード改変のコレクションのインタラクトーム41、52)を尋問することができる。

しかし、PCHi-Cは最低2,000万個の細胞に依存してこの技術を実行するため、発生生物学や臨床応用でよく使用されるような希少な細胞集団の研究が妨げられています。このため、PCHi-Cの実験フレームワークに基づいて、低細胞入力で高分解能プロモーター相互作用を形成するための費用効果が高くカスタマイズ可能な新しい方法である低入力キャプチャHi-C(liCHi-C)を開発しました。最小限のチューブ交換、元のPCHi-Cプロトコルからのステップの交換または排除、反応量の大幅な削減、試薬濃度の変更で実験を行うことで、ライブラリの複雑さが最大化され、わずか50,000細胞で高品質のライブラリを生成することができます53。

低入力キャプチャHi-C(liCHi-C)は、PCHi-Cに対してベンチマークされており、ヒト造血細胞分化中のプロモーター相互作用体再配線の解明、非コード変化によって制御解除される可能性のある新しい疾患関連遺伝子および経路の発見、および染色体異常の検出に使用されています53。ステップバイステップのプロトコルと技術によるさまざまな品質管理は、ライブラリの最終生成とその計算分析までここで詳しく説明します。

Protocol

材料の損失を最小限に抑えるには、(1)DNA低結合チューブとチップ( 材料表を参照)を使用し、(2)チップをサンプル内に導入する代わりにチューブ壁に試薬を配置し、(3)可能であれば、サンプルを上下にピペッティングする代わりに反転によってサンプルを混合し、その後スピンダウンしてサンプルを回収します。 1.細胞固定 浮遊状態で増殖…

Representative Results

liCHi-Cは、わずか50,000細胞で高品質で分解能の高いゲノムワイドプロモーターインタラクトームライブラリを生成する可能性を提供します53。これは、反応量の大幅な削減とプロトコル全体でのDNA低結合プラスチックウェアの使用に加えて、重大な材料損失が発生する元のプロトコルから不要なステップを削除することによって達成されます。これらには、脱架橋後のフェノ?…

Discussion

liCHi-Cは、PCHi-Cと同様の実験フレームワークを使用して、細胞数を大幅に削減した高分解能プロモーターインタラクトームライブラリを生成する機能を提供します。これは、フェノール精製やビオチン除去などの不要なステップを排除することによって大きく達成されます。古典的な核内ライゲーションHi-Cプロトコル57 およびそれに続く派生技術PCHi-Cでは、ビオチンは、後?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

原稿に対するフィードバックを提供してくれたハビエールラボの他のメンバーに感謝します。我々は、CERCAプログラム、カタルーニャ州政府、及びジョセップ・カレーラス財団の制度的支援に感謝する。この研究は、FEDER/スペイン科学イノベーション省(RTI2018-094788-A-I00)、欧州血液学会(4823998)、およびスペインがん協会(AECC)LABAE21981JAVIによって資金提供されました。BMJはラカイシャ銀行財団ジュニアリーダープロジェクト(LCF/BQ/PI19/11690001)から資金提供を受け、LRはAGAUR FIフェローシップ(2019FI-B00017)から資金提供を受け、LT-DはFPIフェローシップ(PRE2019-088005)から資金提供されています。バルセロナ自治大学の生化学および分子生物学博士課程の支援に感謝します。資金提供者の誰も、実験計画や原稿の執筆には関与していませんでした。

Materials

0.4 mM Biotin-14-dATP Invitrogen 19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0 Invitrogen AM9260G
1 M Tris pH 8.0 Invitrogen AM9855G
10x NEBuffer 2 New England Biolabs B7002S Referenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBS Fisher Scientific BP3994
10x T4 DNA ligase reaction buffer New England Biolabs B0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-free Thermo Scientific 28908
20 mg/mL Bovine Serum Albumin New England Biolabs B9000S
5 M NaCl Invitrogen AM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubes Qiuantabio 2302820 For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplification Integrated DNA Technologies – Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappers Nunc 179693 Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes) Any brand
CHiCAGO R package 1.14.0
CleanNGS beads CleanNA CNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTP Promega U120A, U121A, U122A, U123A Or any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mL Eppendorf 30108051
DNA LoBind tube, 2 mL Eppendorf 30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mL New England Biolabs M0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads Invitrogen 65002 For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beads Invitrogen 65602 For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2 Invitrogen 12321D Or any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absolute VWR 20821.321
FBS, qualified Gibco 10270-106 Or any other brand
Glycine Fisher BioReagents BP381-1
GlycoBlue Coprecipitant Invitrogen AM9515 Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP 0.8.2
HindIII, 100 U/µL New England Biolabs R0104T
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mL New England Biolabs M0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL) ZeroTip PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicator Covaris 500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vials Covaris 520045 For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µL New England Biolabs R3131M
Nuclease-free molecular biology grade water Sigma-Aldrich W4502
PCR primers for quality controls Integrated DNA Technologies –
PCR strips and caps Agilent Technologies 410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA Sigma-Aldrich P3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs M0531L For amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) Roche 11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR grade Roche 3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kit Invitrogen Q33230 For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubes Invitrogen Q32856
rCutsmart buffer New England Biolabs B6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX Gibco 61870-010 Or any other brand
SDS – Solution 10% for molecular biology PanReac AppliChem A0676
Sodium acetate pH 5.2 Sigma-Aldrich S7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb library Agilent Technologies 5190-4831 Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1 Agilent Technologies 5190-8645 Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter Agilent Technologies 931107 Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µL Invitrogen 15224025 For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mL New England Biolabs M0202T For ligation in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
T4 DNA polymerase 3000 units/mL New England Biolabs M0203L
T4 PNK 10000 units/mL New England Biolabs M0201L
Tapestation 4200 instrument Agilent Technologies For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Tapestation reagents Agilent Technologies 5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585, For automated electrophoresis in section 9 (dATP-tailing, adapter ligation, and PCR amplification) and
section 11 (Biotin pull-down and PCR amplification). Any other automated electrophoresis system is valid
Triton X-100 for molecular biology PanReac AppliChem A4975
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
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Referanslar

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LiCHi-CChromatin InteractionsGenome OrganizationGene RegulationRegulatory ElementsPromoter-centricSpatiotemporalRare Cell PopulationsLow InputCapture Hi-C

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Rovirosa, L., Tomás-Daza, L., Urmeneta, B., Valencia, A., Javierre, B. M. An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations. J. Vis. Exp. (194), e65316, doi:10.3791/65316 (2023).
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