Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

Yilun Sun

doi:10.3791/65315

JoVE Journal > Biochemistry

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Biyokimya

DNA-蛋白质交联及其翻译后修饰的定量检测

Published: April 21, 2023

doi:

10.3791/65315

Yilun Sun¹

¹Developmental Therapeutics Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute,National Institutes of Health

Özet

本协议强调了一种改进的方法，用于检测和量化DNA-蛋白质交联（DPC）及其翻译后修饰（PTM），包括由拓扑异构酶抑制剂和甲醛诱导的泛素化，SUMO化和ADP-核糖基化，从而允许研究DPC及其PTM的形成和修复。

Abstract

DNA-蛋白质交联（DPC）是常见、普遍存在且有害的 DNA 病变，由内源性 DNA 损伤、酶（拓扑异构酶、甲基转移酶等）功能障碍或外源性药物（如化疗药物和交联剂）引起。一旦诱导DPC，几种类型的翻译后修饰（PTM）就会迅速结合为早期反应机制。已经表明，DPC可以通过泛素，小泛素样修饰剂（SUMO）和聚ADP-核糖进行修饰，它们启动底物以发出各自指定的修复酶信号，并且在某些情况下以顺序方式协调修复。由于PTM快速发生且具有高度可逆性，因此分离和检测通常保持在低水平的PTM偶联DPC一直具有挑战性。这里介绍的是一种免疫测定法，用于纯化和定量检测体内泛素化、SUMO化和ADP核糖基化的DPC（药物诱导的拓扑异构酶DPC和醛诱导的非特异性DPC）。该测定源自RADAR（DNA加合物回收快速方法）测定，该测定用于通过乙醇沉淀分离含有DPC的基因组DNA。归一化和核酸酶消化后，通过使用相应的抗体进行免疫印迹检测 DPC 的 PTM，包括泛素化、SUMO化和 ADP-核糖基化。这种稳健的测定可用于鉴定和表征修复酶促和非酶促DPC的新分子机制，并有可能发现针对调节PTM以修复DPC的特定因子的小分子抑制剂。

Introduction

基因组 DNA 损伤是由于自发衰变、内部损伤和环境因素¹ 而发生的。由此产生的DNA损伤包括受损的碱基，错配，单链和双链断裂，链间和链内交联以及DNA-蛋白质交联（DPC）。当染色质结合的蛋白质通过共价键捕获在DNA上时，就会形成DPC。DPC由内源性DNA病变和反应性代谢物以及外源性药物（如化疗药物和双功能交联剂）诱导。在某些情况下，酶功能障碍也会导致^DPCs的形成2。DPC诱导剂的巨大差异导致共价结合蛋白的身份，形成DPC的染色体区域，与蛋白质交联的DNA的结构类型以及蛋白质^与DNA之间共价键的化学性质存在差异2,3,4。

根据其化学性质，DPC通常分为两组：酶促DPC和非酶促DPC。某些酶（如拓扑异构酶、糖基化酶和甲基/酰基转移酶）在其正常催化反应中通过形成可逆的酶-DNA共价中间体起作用。这些是短寿命的酶-DNA中间体，在被内源性或外源性药物捕获后可以转化为长寿命的酶促DPC，特别是通过化疗药物³。拓扑异构酶 DPC 是真核细胞中最常见的酶促 DPC 之一，可由临床上有用的拓扑异构酶抑制剂（拓扑替康和伊立替康用于拓扑异构酶 I [TOP1] 以及依托泊苷和多柔比星用于拓扑异构酶 II [TOP2]）产生，并且是这些抑制剂的主要治疗机制 ^5,6.DNA 甲基转移酶（DNMT） 1、3A 和 3B 是 5-氮杂-2′-脱氧胞苷（也称为地西他滨）的靶标，并在暴露于药物时形成 DPC⁷。反应剂以及紫外线和电离辐射通过非特异性将蛋白质与DNA交联来诱导非酶促DPC。乙醛和甲醛（FA）等活性醛通常作为细胞代谢的副产物产生，其中FA在甲醇代谢，脂质过氧化和组蛋白去甲基化过程中以微摩尔浓度产生。此外，FA是全球生产的大批量生产化学品，许多人在环境和职业上都暴露于其中^8,9。

酶促和非酶促DPC对细胞都有剧毒，因为它们庞大的蛋白质成分有效地阻碍了几乎所有基于染色质的过程，包括复制和转录，如果不修复，会导致细胞周期停滞和凋亡。在过去的二十年中，DPC的修复得到了积极的研究，并且已经确定了几种蛋白质/途径是直接修复DPC或调节其修复过程的关键因素。例如，已经确定DPC蛋白质体积的蛋白水解是DPC修复的关键步骤，并且蛋白水解可以由蛋白酶SPRTN 10,11,12,13,14，FAM111A^15，GCNA 16,17或26S蛋白酶体复合物^{18,19,20,21,22}催化。，23,24,25,26,27以细胞类型或细胞上下文依赖的方式。这些蛋白酶的鉴定和表征在很大程度上依赖于酶的体内复合物（ICE）测定^28,29和DNA加合物回收（RADAR）测定^30,31的快速方法，两者都从游离细胞蛋白中分离DNA分子及其共价结合蛋白^，以允许使用靶向交联蛋白的抗体通过槽印迹检测DPC。此外，捕获的琼脂糖DNA免疫染色（TARDIS）测定被用作在单细胞水平³²检测和定量DPC的手段。目前，研究人员选择RADAR测定而不是ICE测定来测量DPC，因为ICE测定依赖于使用氯化铯梯度超速离心纯化核酸，这非常耗时，而RADAR测定使用乙醇在更短的时间内沉淀核酸。

近年来，越来越多的证据表明，DPC靶向蛋白酶3,33,34,35的信号传导和募集涉及多种翻译后修饰（PTM）。例如，发现TOP1-和TOP2-DPC均由小泛素样修饰剂（SUMO）-2/3偶联，然后由SUMO E3连接酶PIAS4偶联SUMO-1偶联，与DNA复制和转录无关。顺序的SUMO修饰似乎是泛素的靶标，泛素沉积到SUMO化的TOP-DPC上，并通过称为RNF4的SUMO靶向泛素连接酶通过其赖氨酸48残基形成聚合链。随后，泛素聚合物引发信号并将26S蛋白酶体募集到TOP-DPC^23,36。相同的SUMO-泛素途径最近被证明作用于DNMT1-DPC以及PARP-DNA复合物以修复它们^37,38。此外，据报道，泛素 E3 连接酶 TRAIP 的 SUMO 非依赖性泛素化以复制偶联方式用于蛋白酶体降解的 DPC³⁹。与 TOP-DPC 的蛋白酶体降解类似，复制偶联金属蛋白酶 SPRTN 对酶促和非酶促 DPC 的蛋白水解也需要 DPC 底物的泛素化作为参与 SPRTN^40,41 的机制。描述SUMO化和泛素化的作用需要检测用这些PTM标记的DPC。由于原始的ICE测定和RADAR测定依赖于槽印迹/点印迹设备来测量未消化的DNA样品，因此这两种测定都无法分离和可视化具有不同分子量的PTM偶联DPC物种。为了克服这个问题，我们在通过乙醇沉淀纯化DNA样品并用微球菌核酸酶（一种DNA和RNA内切核酸外切酶）进行样品归一化以释放交联蛋白后消化DNA样品，这使我们能够用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质及其共价PTM。电泳使我们能够使用靶向PTM的特异性抗体检测和定量PTM偶联的DPC。我们最初将这种改进的方法命名为DUST测定，以突出其在检测泛素化和SUMO化TOP-DPCs中的稳健性²³。后来，我们扩大了该测定的使用范围，以定量评估体内TOP1-DPC的ADP核糖基化，使用针对聚ADP-核糖聚合物的抗体²⁰。

这里介绍的是检测和测量泛素化、SUMO化和ADP核糖基化DPC的测定的详细方案，该方案针对由其抑制剂诱导的修饰的TOP-DPC和由FA诱导的非特异性/非酶促DPC进行了优化。该测定通过用离液剂裂解细胞，用乙醇沉淀DNA并用微球菌核酸酶释放其他交联蛋白及其修饰剂来分离PTM偶联的DPC。其他DNA结合的蛋白质及其PTM通过使用特异性抗体的免疫印迹进行定量。该测定为阐明细胞修复酶促和非酶促DPC的分子机制铺平了一条新途径。具体而言，它能够详细研究对调节TOP-DPC降解和修复很重要的PTM的诱导和动力学，从而允许发现新的因素，例如决定PTM的E3连接酶，以及针对这些因素的抑制剂。由于一些负责TOP-DPC修复的PTM可能参与由其他化疗药物（例如铂类药物²²）诱导的DPC的修复，因此该测定也有可能应用于发现新药和合理优化与拓扑异构酶抑制剂或铂基抗肿瘤药物在患者细胞中的组合疗法以指导治疗方案。

Protocol

1. 人胚胎肾293（HEK293）细胞系中的细胞培养和药物治疗制备培养基，Dulbecco 的改良鹰培养基（DMEM），补充有 10% 胎牛血清、1% 2 mM L-谷氨酰胺和 100 单位/mL 青霉素-链霉素。在每个处理条件加上对照中接种 1 x 106 个细胞在 60 mm 板或 6 孔板中。第二天，用选择的DPC诱导剂处理细胞。为了诱导TOP1-DPC及其泛素化和SUMO化，将20μM的TOP1抑制剂喜树碱添加到细胞中，并在20,60和180分钟时收集细胞。为了诱导TOP2α和β-DPC及其泛素化和SUMO化，暴露细胞以将200μM的TOP2抑制剂依托泊苷添加到细胞中，并在20,60和180分钟收集细胞。为了诱导非酶促DPC及其泛素化和SUMO化，在1mM下添加FA并在暴露后2小时收集细胞。为了诱导TOP1-DPC的PARylation，将细胞预处理1小时以阻止聚（ADP-核糖）糖水解酶（PARG）抑制剂在10μM下PDD00017273去PAR化，然后用20μM喜树碱共处理20,60和180分钟。 2. 含有交联蛋白的DNA的分离和标准化处理后用吸力移液器快速吸出培养基，并用冰冷的 1x 磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗细胞。立即在含有 1x 蛋白酶混合物抑制剂、1 mM 二硫苏糖醇（DTT）和 20 mM N-乙基马来酰亚胺（去 SUMO化和去泛素化酶抑制剂）的 600 μL DNAzol 试剂中裂解细胞。在4°C下在振动平台上缓慢搅拌板10分钟。将 1/2 体积的 100% 冷乙醇（0.3 mL）直接加入板中，重复步骤 2.2，直到可见不透明的核酸聚集体。将细胞裂解物转移到1.5mL微量离心管中，并在4°C下使管以最大速度（20,000× g）离心15分钟以沉淀核酸及其交联蛋白。使用吸液管吸出上清液，并在1mL的75%乙醇中洗涤核酸沉淀，然后在4°C下离心2分钟20,000× g 。吸出上清液，以相同的速度向下旋转，并使用P20移液器除去剩余的液体。将颗粒风干5分钟。快速将核酸沉淀溶解在0.1mLddH 2O.通过重复移液重悬沉淀，然后在37°C水浴中孵育，直到沉淀膨胀到至少三倍大（约30分钟）。用超声处理器探头以30%振幅对样品进行超声处理10秒，以完全溶解沉淀。可选步骤：用RNase A / T1混合物（10μgRNase A和25URNase T1）处理样品，并在37°C孵育15分钟。向管中加入1/10体积的3M乙酸钠和2体积的冰冷的100%乙醇，然后以20,000× g 离心10分钟以取回DNA。除去上清液并将沉淀的 DNA 溶解在 0.1 mL ddH2O 中。可选步骤：将样品以20,000 x g 离心5分钟，然后将上清液转移到新管中。使用紫外可见（UV-Vis）光谱仪定量DNA浓度。典型的DNA产量约为600-800 ng/μL。去除RNA后，A260/A280比值应从2.0-2.1降低到1.8-1.9。将 DNA 的浓度调节至 0.12 mL ddH 2 O 中的 400-500 ng/μL.将 20 μL 样品转移到新的微量离心管中作为未消化的 DNA 上样对照（参见步骤2.4）。要消化溶解在剩余 100 μL ddH 2 O 中的 DNA，向样品中加入 2,000 凝胶单位的微球菌核酸酶以及 1/10 体积（~11 μL）的 10x 钙微球菌核酸酶反应缓冲液。在37°C孵育30分钟。 3. 消化DNA样品的蛋白质印迹加入4x Laemmli样品缓冲液，然后将样品煮沸5分钟。将 5-6 μg 消化样品（~15 μL）上样到 4%-20% 聚丙烯酰胺凝胶上，然后使用 SDS-PAGE42 以分离未修饰和 PTM 偶联的 DPC。为了检测FA诱导的非酶DPC物种，将凝胶与考马斯蓝染色剂在室温下孵育过夜。用ddH 2 O洗涤凝胶2小时，并使用成像系统获取图像。转移凝胶并将膜在4°C下孵育过夜，并在封闭缓冲液中适当稀释一抗。为了检测泛素化，抗泛素抗体的稀释比例为1：100。要检测 SUMO-1 或 SUMO-2/3 修饰，请以 1：250 的比例稀释抗 SUMO-1 或抗 SUMO-2/3 抗体。为了检测ADP-核糖基化，抗PAR抗体的稀释度为1：500。要检测总 TOP1-、TOP2α-或 TOP2β-DPC，请以 1：500 的比例稀释抗 TOP1、抗 TOP2α 或抗 TOP2β 抗体。注意：有关抗体稀释的详细信息，请参阅材料表。将 1x PBS-T（0.1% 吐温 20）洗涤膜与在封闭缓冲液中稀释 5,000 倍的二抗在室温下孵育 60 分钟。使用增强化学发光（ECL）试剂显影膜，并使用成像系统获取图像。 4. 未消化DNA样品的槽印迹将 20 μL 未消化的 DNA 样品稀释在 180 μL 磷酸钠缓冲液（25 mM， pH 6.6）中。切割硝酸纤维素膜（0.45μm）并在磷酸钠缓冲液中平衡5分钟。根据制造商的说明组装槽印设备并将其连接到真空系统。通过施加真空用磷酸钠缓冲液洗涤孔。确保井没有泄漏。停止真空，每个样品（1 μg）上样 200 μL DNA。用 200 μL 磷酸钠缓冲液填充空孔。施加真空。当所有孔完全清空时，停止真空，在每个孔中加载200μL磷酸钠缓冲液，然后重复步骤4.6。取回膜并在室温下用5%封闭缓冲液封闭0.5小时。用抗双链DNA（dsDNA）抗体在4°C下以1：5,000稀释过夜进行探针。用 1x PBS-T 洗涤 3 倍，并与 1：5,000 稀释的辣根过氧化物酶（HRP）连接的抗小鼠二抗孵育。使用增强化学发光（ECL）试剂显影膜，并使用成像系统获取图像。 5. 密度分析使用 ImageJ，计算每个条带/涂片的强度相对于未消化 DNA 插槽强度的比率，并将该比率与没有/药物治疗前的细胞的比率标准化。

Representative Results

图1所示的代表性结果显示了药物诱导的TOP1-DPC的形成和动力学及其SUMO化和泛素化。TOP1切割了DNA双链的一条链，并形成了酶-DNA共价中间体，称为TOP1切割复合物（TOP1cc）。喜树碱（CPT）的治疗，一种TOP1抑制剂，结合并稳定TOP1cc，导致长寿命TOP1-DPC的形成。观察到TOP1-DPCs被诱导，并在暴露于CPT后20分钟达到峰值。同时，TOP1-DPC被SUMO-2 / 3修饰，其在CPT处理后20 min也达到峰值。由于SUMO-2和SUMO-3具有95%的序列同一性，因此抗体不能区分彼此。在60分钟时，TOP1-DPC及其SUMO-2 / 3修饰减弱，伴随着其SUMO-1修饰和泛素化的顶峰。药物治疗60分钟后，TOP1-DPC SUMO-1修饰和泛素化水平开始下降。在哺乳动物中，TOP2同工酶通过引入DNA双链断裂以及通过形成瞬时和可逆的酶-DNA共价复合物（TOP2cc）来α和β起作用。TOP2抑制剂，如依托泊苷（ETOP），将TOP2cc转化为TOP2-DPC并诱导其SUMO化和泛素化。类似于TOP1-DPCs及其PTM的动力学，TOP2α-和β-DPC及其SUMO-2/3修饰在20 min达到峰值，然后开始下降;同时，它们的SUMO-1和泛素修饰在60分钟达到峰值（图2）。TOP-DPC的清除已被证明是由蛋白酶体降解引起的，TOP-DPC SUMO化和泛素化的清除可能是由于分别通过其逆转酶的去SUMO化和去泛素化进行循环。图3中的实验检查了FA诱导的非酶促DPC及其PTM。观察到DPC及其SUMO-2/3，SUMO-1和泛素化以FA剂量依赖性方式形成和积累。最后，使用相同的方法用抗PAR抗体定量检测TOP1-DPC的PAR化（图4）。除非向细胞中加入 PARG 抑制剂，否则无法检测到 TOP1-DPC 帕里化，这表明帕里化迅速发生并且是高度动态的。与先前的发现一致，PARGi对去PAR化抑制似乎积累了TOP1-DPC，可能是通过阻断蛋白水解降解。图 1：HEK293 细胞中 CPT 处理后 TOP1-DPC 的形成和动力学及其 SUMO化和泛素化的定量分析。（A）用20μM CPT处理HEK293细胞指定的时间段。收获细胞裂解物并进行改良的RADAR测定和具有指定抗体的蛋白质印迹。使用抗dsDNA抗体作为上样对照对未消化的DNA样品进行槽印迹。（B）使用ImageJ软件量化条带强度，并使用Prism软件绘制。请点击此处查看此图的大图。图2：HEK293细胞中TOP2-DPC的形成和动力学及其SUMO化和泛素化在TOP处理后的定量分析。（A）用200μM ETOP处理HEK293细胞指定的时间段。收获细胞裂解物并进行改良的RADAR测定和具有指定抗体的蛋白质印迹。使用抗dsDNA抗体作为上样对照对未消化的DNA样品进行槽印迹。（B）使用ImageJ软件量化条带强度，并使用Prism软件绘制。请点击此处查看此图的大图。图3：HEK293细胞FA处理时非酶促DPC及其SUMO化和泛素化的定量分析。（A）用指定浓度的FA处理HEK293细胞2小时。收获细胞裂解物并进行改良的RADAR测定和具有指定抗体的蛋白质印迹。使用抗dsDNA抗体作为上样对照对未消化的DNA样品进行槽印迹。（B）使用ImageJ软件量化条带强度，并使用Prism软件绘制。请点击此处查看此图的大图。图 4：HEK293 细胞中 CPT 处理时 TOP1-DPC 及其 PARylation 的定量分析。（A）HEK293细胞用10μM PARGi预处理1小时，然后用CPT共处理指定的时间段。收获细胞裂解物并进行改良的RADAR测定和具有指定抗体的蛋白质印迹。使用抗dsDNA抗体作为上样对照对未消化的DNA样品进行槽印迹。（B）使用ImageJ软件量化条带强度，并使用Prism软件绘制。请点击此处查看此图的大图。

Discussion

所述方法允许测量哺乳动物细胞中的酶促和非酶促DNA-蛋白质交联，并且是研究其泛素化，SUMO化和ADP-核糖基化的唯一合适方法。ICE或RADAR测定后的槽印迹允许使用其抗体快速检测特定的酶促DPC，例如TOP-DPC。然而，该方法需要注意的是它无法分离不同分子量的蛋白质，因此无法确定PTM偶联DPC的大小。所述方法通过释放与微球菌核酸酶的交联蛋白来解决问题，微球菌核酸酶将DNA降解为具有末端3′-磷酸的寡核苷酸，从而允许SDS-PAGE完全分离蛋白质（与寡核苷酸偶联）。因此，用泛素、SUMO 或 ADP-核糖单体和不同尺寸的聚合物修饰的 DPC 可以通过靶向这些 PTM 的抗体进行可视化和定量，从而能够详细研究它们的形成和动力学。为了确保可重复性并计算统计学意义，需要对实验进行生物学重复。

该测定最常见的问题之一是乙醇沉淀后DNA产量低。一方面，DNA产量可以通过更多的起始材料（细胞）来提高。另一方面，在平板而不是Eppendorf管中用乙醇孵育细胞裂解物可以显着改善DNA分子的聚集，从而促进其沉淀。在未经药物治疗的样品中观察到的非特异性信号可能表明非共价蛋白污染。如果是这种情况，可以考虑在超声处理之前用高盐缓冲液洗涤DNA沉淀以去除污染物。还建议在超声处理和微球菌核酸酶消化后旋转DNA样品，并丢弃任何不溶物。在信号差或没有信号的情况下，可以尝试几种潜在的解决方案。首先，可以增加用于SDS-PAGE和免疫印迹的DNA上样量。为了使 SUMOylized 和泛素化的 DPC 物种可检测，建议将至少 4 μg DNA 加载到凝胶上。其次，可以增加药物浓度以诱导更高水平的DPC及其相关的PTM。第三，如果条带/涂片看起来较弱，建议将印迹与一抗一起孵育一天。2天的孵育可以显着增强信号，从而减少独立实验的生物变异性²³。用于重新染色的膜剥离不可避免地会导致一定量的PTM偶联DPC物种的损失，这些物质已经处于低丰度。因此，强烈建议使用单独的凝胶进行泛素和SUMO检测，而不是重新探测一个印迹。此外，DNA沉淀必须用75%乙醇洗涤，以除去剩余的含有胍盐的DNAzol，然后再溶解在H 2 O或任何其他溶剂中，否则在加入Laemmli上样缓冲液后会导致样品结晶。

与繁琐的ICE测定相比，所述方法的工作流程更具时间效率，因为它依赖于快速乙醇沉淀而不是耗时的氯化铯超速离心来分离基因组DNA。以一定的代价，基于乙醇的纯化带来了少量的蛋白质污染物，这些污染物对于免疫检测来说通常可以忽略不计。然而，当涉及到分析研究时，例如基于质谱的蛋白质组学分析或需要准确性和精密度的下一代测序，氯化铯密度梯度离心仍然是分离纯、高丰度DNA的更可靠方法。该方法还可以潜在地应用于分析交联蛋白上的修饰位点，以及使用适当的基于质谱的方法测定多泛素化和多SUMO化的连接类型。

值得注意的是，该测定允许识别和表征调节PTM的因子以进行DPC修复。例如，无偏高通量筛选方法（RNA干扰和CRISPR）是发现泛素E3连接酶，SUMO E3连接酶及其相关辅助因子减轻DPC诱导剂细胞毒性的有力工具。所描述的方法通过确定它们是否通过修复DPC来帮助细胞存活DPC诱导剂，从而能够对这些蛋白质进行分子验证。靶向这些蛋白质的新型小分子抑制剂，例如，通过虚拟筛选，也可以使用该协议进行验证。鉴于拓扑异构酶抑制剂是最常用的化疗药物之一，这种强大的测定可以开发为开发与临床拓扑异构酶抑制剂协同作用的药物的工具。

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作部分得到了国家癌症研究所癌症研究中心博士后研究过渡奖的大力支持。

Materials

10x Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher	70011069
4–20% precast polyacrylamide gel	Bio-Rad	4561096
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747
AcquaStain (coomassie blue)	Bulldog Bio	AS001000
anti-dsDNA (mouse monoclonal)	Abcam	27156	1: 5,000 dilution is recommended
anti-PAR (mouse monoclonal)	R&D systems	4335-MC-100	1: 500 dilution is recommended
anti-SUMO-1(rabbit monoclonal)	Cell Signaling Technology	4940	1: 250 dilution is recommended
anti-SUMO-2/3 (rabbit monoclonal)	Cell Signaling Technology	4971	1: 250 dilution is recommended
anti-TOP1 (mouse monoclonal)	BD Biosciences	556597	1: 500 dilution is recommended
anti-TOP2α (mouse monoclonal)	Santa Cruz Biotechnology	SC-365799	1: 250 dilution is recommended
anti-TOP2β (mouse monoclonal)	Santa Cruz Biotechnology	SC-25330	1: 250 dilution is recommended
anti-ubiquitin (mouse monoclonal)	Santa Cruz Biotechnology	SC-8017	1: 100 dilution is recommended
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	499609	Used for micrococcal nuclease digestion
Camptothecin	Sigma-Aldrich	PHL89593
ChemiDo MP imaging system	Bio-Rad	12003154
Disodium phosphate	Sigma-Aldrich	5438380100	Used to make sodium phosphate buffer
DNAzol	Thermo Fisher	10503027
DTT (dithiothreitol)	Thermo Fisher	R0861
Dulbecco's modified eagle's medium	Sigma-Aldrich	11965084
Ethyl alcohol, 200 proof	Sigma-Aldrich	E7023
Etoposide	Sigma-Aldrich	1268808
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	47608
Graphpad Prism Software	GraphStats	Prism 9.0.0
HRP-linked Mouse IgG	Cytiva	NA931	1: 5,000 dilution is recommended
HRP-linked Rabbit IgG	Cytiva	NA934	1: 5,000 dilution is recommended
ImageJ Software	NIH, USA	ImageJ 1.53e
L-Glutamine	Fisher Scientific	25030081
Maximum sensitivity ECL substrate	Thermo Fisher	34095
Micrococcal nuclease	New England BioLabs	M0247S
Monosodium phosphate	Sigma-Aldrich	S3139	Used to make sodium phosphate buffer
NanoDrop 2000 spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000
N-ethylmaleimide	Thermo Fisher	23030	DeSUMOylation/deubiquitylation inhibitor
Nitrocellulose membrane, 0.45 µm	Bio-Rad	1620115
Non-fat dry milk	Bio-Rad	1706404XTU
PDD00017273	Selleckchem	S8862	Poly(ADP-ribose) glycohydrolase inhibitor
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
Protease inhibitor cocktail	Thermo Fisher	78430
Q700 sonicator	Qsonica	Q700-110
Ready-to-assemble PVDF transfer kit	Bio-Rad	1704274
Slot-blot apparatus	Bio-Rad	1706542
Slot-blot filter paper	Bio-Rad	1620161
Trans-Blot turbo transfer system	Bio-Rad	1704150
Tris/Glycine/SDS electrophoresis buffer	Bio-Rad	1610732
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179
Vertical electrophoresis cell	Bio-Rad	1658004

Referanslar

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DNA-protein Crosslinks DNA Damage Repair Topoisomerase Inhibitors PARP Inhibitors Aldehydes Post-translational Modifications Deubiquitylation SUMOylation ADP-ribosylation In Vivo Complex Of Enzyme Assay Rapid Approach To DNA Adduct Recovery Assay Immunofluorescence Quantitation Kinetics Formation

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Sun, Y. Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications. J. Vis. Exp. (194), e65315, doi:10.3791/65315 (2023).