基于荧光报告基因和染色质免疫沉淀法（ChIP）分析 秀丽隐杆线虫 的跨代表观遗传

注：检测时间线如图 1所示。 1. RNAi线虫生长培养基（RNAi-NGM）平板的制备 将含有GFP或对照RNAi载体的大 肠杆菌 HT115（DE3）从甘油储备液中划出到补充有100μg/ mL氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB）琼脂平板上。将细菌在37°C孵育过夜。 第二天，根据标准方案18制备RNAi-NGM板（1.7%[w/v]琼脂，0.3%[w/v]NaCl，0.25%[w/v]蛋白胨，1mM CaCl 2,5μg/ mL胆固醇，25mM磷酸钾缓冲液[pH 6.0]，1mM MgSO4,25μg/ mL羧苄青霉素和5mM异丙基β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷[IPTG]）。对于测定中的每种菌株，准备至少六个接种有GFP RNAi的RNAi-NGM板（三个生物学重复中的每一个两个板）和两个接种对照RNAi的RNAi-NGM板（一个生物学重复）。 用箔纸松散地将盘子包裹起来以避光，并在室温下放置过夜晾干。 在 RNAi-NGM 平板倾倒的同一天，制备 4 mL RNAi 细菌的液体培养物。在无菌条件下，将补充有 10 μg/mL 四环素和 100 μg/mL 氨苄青霉素的 4 mL LB 肉汤分装到培养管中。将LB琼脂平板中的单个菌落选入每个管中，并在37°C下振荡约16小时孵育过夜。 将RNAi细菌接种到RNAi-NGM板上。过夜生长后，使用LB肉汤以1：5稀释的细菌测量培养物的光密度（OD600）。 使用补充有 10 μg/mL 四环素和 100 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 肉汤将 RNAi 细菌稀释至相对 OD600 为 2。 在无菌条件下，将 150 μL 对照或 GFP RNAi 细菌加入每个 RNAi-NGM 板上。 使用前用箔纸覆盖板，让细菌在室温下生长至少24小时。注意：未使用的RNAi-NGM板可以在4°C下在黑暗的密封容器中倒置储存长达1周。 2. 开始RNAi遗传测定：漂白和接种P0代胚胎 注意：在开始RNAi遗传测定之前，含有GFP报告基因mjIs134 [mex-5p：：gfp-h2b：：tbb-2 3’UTR]7 的蠕虫应在21°C下保持至少两代。 在RNAi遗传测定开始前4天（96小时）（图1），将三个或四个妊娠成虫选入每个接种有OP50-1细菌的35mm标准NGM板上。注意：每个菌株三个NGM板就足够了。对于生育能力受损的菌株，每块板可能需要四只以上的动物。 4 天后，确保成年人群已开始在培养皿上产下胚胎。使用补充有Triton X-100（TX-100）（22mM KH 2 PO 4,42mM Na2HPO 4,86mM NaCl，1mMMgSO 4,0.01%（v / v）TX-100）的800μLM9缓冲液将蠕虫从板上洗入1.5mL管中。重复洗涤并池入同一管中。 通过漂白将胚胎从群体中分离出来，如下所示。用漂白剂（6%次氯酸钠）和10N NaOH以1.5：1的体积比制备漂白溶液。准备足够的量，以便每个样品可以使用 250 μL。 将 1.5 mL 管与蠕虫以 1,000 x g 离心 1.5-2 分钟。 吸出上清液，留下 100 μL 而不干扰蠕虫“沉淀”。或者，可以将管子放置约2分钟，以使蠕虫在吸气前沉淀。 向每个试管中加入 650 μL ddH2O，以达到 750 μL 的最终体积。注意：以下步骤具有时效性。 向每个试管中加入 250 μL 漂白溶液并启动计时器。 每1-2分钟，彻底涡旋试管。5分钟后，检查立体镜下的蠕虫，以监测成虫的降解。 继续涡旋，直到蠕虫完全溶解，只剩下胚胎。立即将试管以1,000× g 离心1.5分钟。注意：漂白通常在6-7分钟内完成，但应在立体镜下以足以观察释放的胚胎（40x）的放大倍率进行监测。不要将蠕虫长时间放在漂白剂中，因为这会损害胚胎。 离心后，吸出上清液并留下约 50-100 μL。 加入 1 mL 含 TX-100 的 M9 缓冲液洗涤并通过涡旋混合。再次以1,000× g 离心1.5-2分钟，再洗涤至少两次。 从最终洗涤中吸出上清液，并在试管中留下约 100 μL。涡旋混合。将 2 μL 从每个试管移液两次到标记的载玻片上。使用计数器对胚胎进行计数，以估计每微升胚胎的浓度。注意：此处可以使用具有多个磨砂孔的载玻片来计数多个菌株的重复。计数载玻片可以清洗和重复使用。 为了开始半同步的种群增长，将含有250个胚胎的体积混合并移液到每个RNAi-NGM板上。每次重复使用两个板。让液体吸收。 对于用RNAi处理的P0世代，在21°C孵育4天（96小时）（从胚胎到成年）。时间可能因基因型而异。 图1：RNAi遗传检测示意图。 RNAi-NGM 板制备和 RNAi 遗传测定设置的建议时间表。在第 -4 天将妊娠成虫采摘到接种有 OP50-1 的 NGM 平板上。4天后，将成年后代漂白，并将胚胎接种到RNAi-NGM平板上。将P0世代在21°C下暴露于RNAi中4天。 一旦蠕虫达到成年期，就会通过漂白对重复进行传代，并在每一代中对种系GFP表达进行评分。 请点击这里查看此图的较大版本. 3. 种系GFP表达每一代的传代和评分 注意：为了便于评分，请使用黑胶唱片创建具有线性脊的琼脂糖垫以排列蠕虫。这种方法改编自 Rivera Gomez 和 Schvarzstein19。 通过在微波炉中加热将琼脂糖溶解在小烧瓶中的ddH2O中，制备1%（w / v）琼脂糖。加入搅拌棒并用箔纸盖住。如果重熔，在搅拌的同时在200°C的加热板上加热琼脂糖。熔化后，将热量降低至80°C。 使用 800 μL 含 TX-100 的 M9 缓冲液将蠕虫从 NGM 板上洗净到 1.5 mL 管中。清洗板两次以去除所有妊娠成虫。检查立体镜下的板，以确认动物已被有效收集。 将试管以1,000× g 离心1.5-2分钟或让蠕虫沉降2分钟。吸出上清液并留下 100 μL，而不会干扰蠕虫“沉淀”。 准备琼脂糖垫以安装蠕虫，如下所示。使用玻璃巴斯德移液管（窄端折断）将一滴熔化的1%（w / v）琼脂糖滴到黑胶唱片（前面描述19）上。 定向载玻片，使记录上的线条水平或垂直，然后将载玻片快速放在琼脂糖液滴上。等待大约 30 秒，然后从记录中取出载玻片。注意：如果对多种基因型进行评分，则在一张载玻片上制作更大的琼脂糖垫并使用刀片将其切成两半可能很有用。 将蠕虫安装到琼脂糖垫上。在立体镜下，向琼脂糖垫中加入约5μL的5mM左旋咪唑。左旋咪唑稀释液应每周新鲜。 轻轻轻弹蠕虫管，将 5-10 μL 蠕虫混合并转移到琼脂糖垫上。在添加蠕虫时通过肉眼估计蠕虫的数量，以便每次重复大约有 40 个蠕虫。 使用睫毛镐将蠕虫排成一排，以便于评分。添加玻璃盖玻片。注意：以这种方式安装动物的载玻片可以持续几个小时，然后才会变干。 在对载玻片进行评分之前，使用漂白方案（参见步骤2.3）将胚胎与剩余的动物分离。将 250 个胚胎接种到 35 mm NGM 平板上，接种有 OP50-120。一旦液体被吸收，倒置板并将其放回21°C培养箱中。 使用带有 GFP 滤光片组的荧光立体镜。使用计数计数器计数并记录每次重复的载玻片上GFP阳性和GFP阴性蠕虫的数量。注意：GFP阳性蠕虫在其生殖系和 子宫内胚胎中具有核GFP表达。GFP阴性蠕虫的种系不会发出荧光，但是，随着GFP在后代中开始重新打开，荧光可能会变暗。安装额外的非转基因蠕虫菌株以解释观察到的任何自发荧光可能会有所帮助。 如上所述，在21°C下大约每4天（96小时）漂白一次。 或者，为方便起见，可以按 3 天/4 天交替的时间表进行传代。如果交替进行，则为较短的传代接种额外的~50个胚胎，因为72小时后胚胎的产量可能会降低。注意：在胚胎铺板后 4 天保持 P0 代传代时间一致。 4. ChIP 动物采集 注：动物数量和时间取决于菌株、发育阶段、表位和免疫沉淀 （IP） 靶标的数量。在下面的示例中，收集三个 IP 的动物：H3K9me3、组蛋白 H3 和 IgG 对照。ChIP 方案改编自 Askjaer 等人 21。 在 ChIP 样本采集之前，将上一代 RNAi 遗传检测再增加 3 个 NGM 板（每次重复至少增加 4 个板）。在21°C下生长4天。 漂白妊娠成虫以分离胚胎（参见步骤2.3）。 对于每个菌株，将大约3,500个胚胎铺在14个平板上（每块平板250个），并在21°C下生长3天至年轻成人阶段。 用含有0.01%（v / v）TX-100（PBS / TX）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）将动物洗涤到1.5mL管中。以1,000× g 离心2分钟。将动物从一个菌株中吸出并汇集到一个管中，并用至少 1 mL PBS/TX 再洗涤三次。 吸出至1,000μL，倒置混合，并计数3μL中的动物数量3次（参见步骤2.3.9）。 计算动物的浓度，并将相当于3,000只动物的体积转移到新管中进行甲醛交联。 确保总体积至少是蠕虫颗粒体积的 10 倍。 5.甲醛交联 注意： 在通风橱中使用甲醛以防止接触蒸汽。 将甲醛（1.8%终浓度）添加到装有蠕虫的试管中。在室温下旋转 6 分钟。 立即在液氮中冷冻。实验可以在此步骤暂停，样品可以储存在-80°C。 将交联样品在室温水浴中解冻3分钟，并在室温下旋转16分钟。 加入1.25M甘氨酸至终浓度为125mM，旋转5分钟。注意：在磁珠洗脱之前，将样品保持在冰上或4°C，并使用冰冷的缓冲液。 将样品以1,000× g 离心3分钟。每次用 1 mL PBS/TX 洗涤 3 次。用 1 mL 重悬缓冲液（150 mM NaCl、50 mM HEPES-KOH [pH 7.5]、1 mM 乙二胺四乙酸 [EDTA]、0.01% TX-100、蛋白酶抑制剂 [每 5 mL 一片]）洗涤两次。 最后一次洗涤后，留出足够的缓冲液，以确保总体积至少是沉淀体积的三倍，并且至少为 ~100 μL。 6. 超声处理 注意：超声处理参数取决于超声仪的类型和型号以及动物阶段。样品体积和浓度、开/关间隔、循环次数和功率设置等参数需要根据经验进行优化。例如，在超声处理的时间过程中，使用蛋白质测定法监测蠕虫裂解，并确定浓度何时达到平台期。此外，通过在1.5%琼脂糖/三乙酸酯-EDTA（TAE）凝胶上电泳DNA进行电泳，监测基因组DNA的平均剪切大小何时约为200-1,000 bp。 测量上一步的样品体积。将 90-120 μL 混合并分装到聚苯乙烯超声处理管中。 加入等体积的含有 2x 去污剂（150 mM NaCl、50 mM HEPES-KOH [pH 7.5]、1 mM EDTA、0.2% 脱氧胆酸钠、0.7% sarkosyl）的重悬缓冲液。 在4°C下以50%功率在水浴超声仪中超声处理7分钟（20秒开/40秒关）。 通过移液轻轻混合。重复超声处理7分钟。 将超声处理的裂解物转移到 1.5 mL 试管中。加入 0.5 体积不含去污剂的重悬缓冲液（150 mM NaCl、50 mM HEPES-KOH [pH 7.5]、1 mM EDTA）（例如，向 200 μL 样品中加入 100 μL 缓冲液）。 在4°C下以13,000× g 离心15分钟。 保留裂解物上清液并转移到新管中。 或者，进行蛋白质测定以确定每种裂解物的浓度。此步骤可用于大样本量或批间比较。然而，如上所述标准化动物数量适用于此处描述的样品量，因为与qPCR测定的染色质/ DNA产量具有更好的相关性。 7. 免疫沉淀 注：将抗体和磁珠的量与裂解物的体积和浓度成比例。 将裂解物上清液分成四份：每个 IP 三个相等体积，一个 IP 体积的 10% 作为起始量（例如，100 μL IP #1、100 μL IP #2、100 μL IP #3、10 μL 起始量）。将IP裂解物转移到200μL PCR管中，并将输入裂解物在-20°C下储存在1.5mL管中。 向适当的 IP 样品中加入 0.5 μg 抗 H3K9me3 抗体、抗组蛋白 H3 抗体或 IgG。在4°C下旋转孵育过夜。 第二天，将 9 μL 蛋白 G 包被的磁珠（每个 IP 分装到单个 1.5 mL 试管中）中。用 1 mL FA-150（150 mM NaCl、50 mM HEPES-KOH [pH 7.5]、1 mM EDTA、1% TX-100、0.1% 脱氧胆酸钠）洗涤珠子两次。 将FA-150缓冲液中的磁珠重悬至上述步骤7.3中从原液中取出的原始体积。向每个 IP 中加入 7.5 μL。在4°C下旋转孵育2小时。 8. 洗涤和洗脱 注意：为确保磁珠不会变干，请在吸出前一次洗涤后快速添加每次洗涤或洗脱缓冲液。 每次使用 0.2-1 mL 以下缓冲溶液洗涤珠子。将珠子收集在磁性支架上以吸出洗涤液。旋转将每次洗涤在4°C孵育5分钟。请按照以下顺序操作。用 FA-150 洗涤两次。 用FA-1M洗涤一次（FA-150用1M NaCl洗涤一次）。 用FA-0.5M洗涤一次（FA-150用0.5M NaCl洗涤一次）。转移到新的PCR管中。 用TE-LiCl（250mM LiCl，10mM Tris-Cl [pH 8.0]，1mM EDTA，1%IGEPAL CA-630,1%脱氧胆酸钠）洗涤一次。 用TE+（50mM NaCl，10mM Tris-Cl [pH 8.0]，1mM EDTA，0.005%IGEPAL CA-630）洗涤两次。注意：除非另有说明，否则在室温下继续样品处理。 吸出最后的洗涤缓冲液。用 50 μL ChIP 洗脱缓冲液（200 mM NaCl、10 mM Tris-Cl [pH 8.0]、1 mM EDTA、1% 十二烷基硫酸钠 [SDS]）重悬磁珠，并转移到 1.5 mL 试管中。 在热混合器中在65°C洗脱15分钟，每分钟以1,000rpm混合5秒。 将珠子收集在磁性支架上，并将上清液转移到新管中。 用另外 50 μL ChIP 洗脱缓冲液重复洗脱。将上清液合并至总计 100 μL。 继续进行反向交联和 DNA 洗脱，如下所述。 9. 反向交联和DNA洗脱 解冻输入裂解物样品。用 ChIP 洗脱缓冲液加满至 100 μL。 向每个 IP 和输入样品中加入 16.5 μg RNase A。在37°C孵育1小时。 加入40μg蛋白酶K，在55°C孵育2小时。然后，在65°C孵育过夜。 将样品冷却至室温，并用离心柱试剂盒纯化DNA。 10. qPCR反应的建立和运行 注：应修改引物、反应设置和热循环仪参数，以符合制造商对所用qPCR反应混合物的建议。 制备靶向 GFP RNAi 报告基因和 H3K9me3 阳性和阴性富集对照区域的引物组。底漆熔融温度为60°C。 引物序列见 材料表 。 对于起始 DNA，进行四次四倍连续稀释（例如，1：5、1：20、1：80、1：320）。注：IP DNA 可直接使用或稀释（例如，1：2 或 1：3）以允许更多反应。稀释液的适用性必须根据经验确定，因为qPCR性能可能会受到影响。 在一个PCR板上组织与一组引物相对应的所有反应。为每个起始 DNA 稀释液和每个 IP DNA 样品设置技术重复反应。每个 10 μL 反应包含 1.5 μL 输入或 IP DNA（或洗脱缓冲液作为对照）、qPCR 预混液（1x 终浓度）、正向引物和反向引物（每个引物终浓度为 400 nM）。 在实时热循环仪上，运行以下程序：初始变性：95°C4分钟;扩增和荧光检测：95°C10秒和60°C30秒的40个循环，板读数;最终延伸：60°C5分钟;熔体曲线：从 60 °C 到 90 °C，增量为 0.5 °C，每步 5 秒。 11. 确定扩增效率并验证产品特异性 对于每组输入 DNA 稀释度，在 x 轴上用 [log10（1/dilution）] 绘制四个数据点，在 y 轴上用 [input Cq] 绘制。确定最佳拟合线的斜率。 计算扩增效率。理想的引物组应始终显示 95%-100% 的效率。 检查所有反应是否都有一个尖锐的熔融曲线峰，并且具有相同引物组的反应是否具有相同的熔融温度。多个峰或不同的熔解温度可能表明非特异性扩增。 或者，在室温下在标准 2% 琼脂糖/TAE 凝胶上进行反应，以验证产物条带大小。 12. 计算输入百分比 计算输入稀释因子。由于 IP 裂解物体积的 10% 保存为输入，因此 1：5 稀释输入 DNA 的稀释因子为 50。 确定IP稀释因子。如果在qPCR之前未稀释IP DNA，则稀释因子为1。 计算 IP 和输入之间的 Cq 差值，根据稀释因子进行调整。 计算输入的百分比。