Alignement de fibrogrammes de tomographie par cohérence optique en lumière visible avec des images confocales de la même rétine de souris
Özet
Le présent protocole décrit les étapes de l’alignement des images in vivo de la tomographie par cohérence optique en lumière visible (vis-OCTF) avec des images confocales ex vivo de la même rétine de souris dans le but de vérifier la morphologie observée des faisceaux axonaux des cellules ganglionnaires de la rétine dans les images in vivo.
Abstract
Ces dernières années, l’imagerie rétinienne in vivo , qui fournit des informations non invasives, en temps réel et longitudinales sur les systèmes et les processus biologiques, a été de plus en plus utilisée pour obtenir une évaluation objective des lésions neuronales dans les maladies oculaires. L’imagerie confocale ex vivo de la même rétine est souvent nécessaire pour valider les résultats in vivo , en particulier dans la recherche animale. Dans cette étude, nous avons démontré une méthode d’alignement d’une image confocale ex vivo de la rétine de souris avec ses images in vivo . Une nouvelle technologie d’imagerie prête à l’emploi appelée fibre de tomographie par cohérence optique en lumière visible (vis-OCTF) a été appliquée pour acquérir des images in vivo de la rétine de souris. Nous avons ensuite réalisé l’imagerie confocale de la même rétine que le « gold standard » pour valider les images in vivo vis-OCTF. Cette étude permet non seulement d’approfondir l’étude des mécanismes moléculaires et cellulaires, mais aussi d’établir les bases d’une évaluation sensible et objective des lésions neuronales in vivo.
Introduction
Les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) jouent un rôle essentiel dans le traitement de l’information visuelle, recevant des entrées synaptiques par l’intermédiaire de leurs arbres dendritiques dans la couche plexiforme interne (IPL) et transmettant l’information via leurs axones dans la couche de fibres nerveuses rétiniennes (RNFL) au cerveau 1,2,3,4. Dans les affections pathologiques telles que le glaucome, la dégénérescence précoce du CGR peut entraîner des changements subtils dans le RNFL, la couche de cellules ganglionnaires (GCL), l’IPL et le nerf optique chez les patients et les modèles de rongeurs 5,6,7,8,9. La détection précoce de ces changements morphologiques dans les CGR est donc essentielle pour une intervention rapide afin de prévenir les CGR et la perte de vision.
Nous avons récemment mis au point une nouvelle technologie d’imagerie prête à l’emploi, appelée tomographie par cohérence optique en lumière visible (vis-OCT), afin de répondre au besoin de surveillance in vivo des lésions du CGR. Vis-OCT a amélioré la résolution axiale, atteignant 1,3 μm dans la rétine10,11, ce qui a permis de visualiser les faisceaux axonales RGC individuels dans le RNFL. Par la suite, la fibre vis-OCT (vis-OCTF) a été établie pour suivre et quantifier les dommages au CGR au niveau du faisceau axonale unique chez les souris11,12,13. Cependant, l’imagerie confocale ex vivo de la même rétine que l’étalon-or est souvent nécessaire pour valider les résultats in vivo. Par conséquent, cette étude démontrera comment aligner les images videodan vivo acquises par vis-OCTF avec les images confococaux ex vivo de la même rétine de souris. Le protocole vise à valider les résultats videodan vivo par imagerie confocale ex vivo et à établir une base pour examiner les changements moléculaires et cellulaires sous-jacents aux dommages causés par le CGR dans des conditions pathologiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il y a deux étapes dans ce protocole qui nécessitent une attention particulière. Tout d’abord, il est nécessaire de s’assurer que l’animal est sous anesthésie profonde et que ses yeux sont complètement dilatés avant l’imagerie vis-OCT. Si les souris ne sont pas correctement anesthésiées, leur respiration rapide peut entraîner des mouvements instables des images du visage , ce qui peut nuire à la qualité du fibrogramme. De plus, une dilatation insuffisante peut également avoir un impact néga…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude est financée par la subvention Shaffer de la Fondation pour la recherche sur le glaucome, le prix de collaboration 4-CA Cavalier, R01EY029121, R01EY035088 et la Fondation Knights Templar Eye.
Materials
| Equipment | |||
| Halo 100 | Opticent Health, Evanston, IL | ||
| Zeiss LSM800 microscope | Carl Zeiss | ||
| Drugs and antibodies | |||
| 4% paraformaldehyde (PFA) | Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 | 1-2 drops | |
| Bovine serum albumin powder | Fisher Scientific, BP9706-100 | 1:10 | |
| Donkey anti Mouse Alexa Fluor 488 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 | 1:1,000 | |
| Donkey anti rat Alexa Fluor 594 dye | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 | 1:1,000 | |
| Euthasol (a mixture of pentobarbital sodium (390 mg/mL) and phenytoin sodium (50 mg/mL)) | Covetrus, NDC 11695-4860-1 | 15.6 mg/mL | |
| Ketamine | Covetrus, NADA043304 | 114 mg/kg | |
| Mouse anti-Tuj1 | A gift from Anthony J. Spano, University of Virginia | 1:200 | |
| Normal donkey serum(NDS) | Millipore Sigma, S30-100 mL | 1:100 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), pH 7.4 (Contains 1370 mM NaCl, 27 mM KCl, 80 mM Na2HPO4, and 20 mM KH2PO4) |
Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3 | 1:10 | |
| Rat anti-ICAM-2 | BD Pharmingen, Cat#553325 | 1:500 | |
| Tropicamide drops | Covetrus, NDC17478-102-12 | ||
| Triton X-100 (Reagent Grade) |
VWR, CAS: 9002-93-1 | 1:20 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories Inc. H2000-10 | ||
| Xylazine | Covetrus, NDC59399-110-20 | 17 mg/kg |
Referanslar
- Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. Development of retinal ganglion cell structure and function. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal ganglion cells: current status and implications for neuronal classification. Annual Review of Neuroscience. 38, 221-246 (2015).
- Seabrook, T. A., Burbridge, T. J., Crair, M. C., Huberman, A. D. Architecture, function, and assembly of the mouse visual system. Annual Review of Neuroscience. 40, 499-538 (2017).
- Cang, J., Savier, E., Barchini, J., Liu, X. Visual function, organization, and development of the mouse superior colliculus. Annual Review of Vision Science. 4, 239-262 (2018).
- Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annual Review of Vision Science. 2, 235-254 (2016).
- Whitmore, A. V., Libby, R. T., John, S. W. Glaucoma: thinking in new ways-a role for autonomous axonal self-destruction and other compartmentalised processes. Progress in Retinal and Eye Research. 24 (6), 639-662 (2005).
- Syc-Mazurek, S. B., Libby, R. T. Axon injury signaling and compartmentalized injury response in glaucoma. Progress in Retinal and Eye Research. 73, 100769 (2019).
- Puyang, Z., Chen, H., Liu, X. Subtype-dependent morphological and functional degeneration of retinal ganglion cells in mouse models of experimental glaucoma. Journal of Nature and Science. 1 (5), (2015).
- Tatham, A. J., Medeiros, F. A. Detecting structural progression in glaucoma with optical coherence tomography. Ophthalmology. 124, S57-S65 (2017).
- Shu, X., Beckmann, L., Zhang, H. Visible-light optical coherence tomography: a review. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-14 (2017).
- Miller, D. A., et al. Visible-light optical coherence tomography fibergraphy for quantitative imaging of retinal ganglion cell axon bundles. Translational Vision Science and Technology. 9 (11), (2020).
- Beckmann, L., et al. In vivo imaging of the inner retinal layer structure in mice after eye-opening using visible-light optical coherence tomography. Experimental Eye Research. 211, 108756 (2021).
- Grannonico, M., et al. Global and regional damages in retinal ganglion cell axon bundles monitored non-invasively by visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Journal of Neuroscience. 41 (49), 10179-10193 (2021).
- Allen-Worthington, K. H., Brice, A. K., Marx, J. O., Hankenson, F. C. Intraperitoneal Injection of Ethanol for the Euthanasia of Laboratory Mice (Mus musculus) and Rats (Rattus norvegicus). J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (6), 769-778 (2015).
- Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, Behavioral, and Histologic Responses to Various Euthanasia Methods in C57BL/6NTac Male Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (1), 69-78 (2017).
- Chen, H., et al. Progressive degeneration of retinal and superior collicular functions in mice with sustained ocular hypertension. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56 (3), 1971-1984 (2015).
- Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension to characterize visual defects. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 78 (78), (2013).
- Gao, J., et al. Differential effects of experimental glaucoma on intrinsically photosensitive retinal ganglion cells in mice. Journal of Comparative Neurology. 530 (9), 1494-1506 (2022).
- Thomson, B. R., et al. Angiopoietin-1 knockout mice as a genetic model of open-angle glaucoma. Translational Vision Science and Technology. 9 (4), (2020).
- Feng, L., et al. Sustained ocular hypertension induces dendritic degeneration of mouse retinal ganglion cells that depends on cell type and location. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (2), 1106-1117 (2013).
- Grannonico, M., et al. Longitudinal analysis of retinal ganglion cell damage at individual axon bundle level in mice using visible-light optical coherence tomography fibergraphy. Translational Vision Science and Technology. 12 (5), (2023).
