Inmunofluorescencia múltiple combinada con análisis de imágenes espaciales para la evaluación clínica y biológica del microambiente tumoral

Todas las muestras utilizadas en el presente protocolo provienen de un estudio aprobado por los comités de ética locales y autorizado por la autoridad competente. Todos los participantes en el estudio dieron su consentimiento informado por escrito. El ensayo está registrado con ClinicalTrials.gov (NCT03608046). 1. Inmunofluorescencia múltiple Seccionamiento FFPEFije el tejido en paraformaldehído al 4% e incruste el tejido fijo en parafina. Corte secciones de 5 μm y colóquelas en portaobjetos de microscopio adhesivo. Seque los portaobjetos durante la noche a temperatura ambiente (RT). Desparafinización e inhibición de peroxidasas endógenasDesparafinar los tejidos sumergiendo los portaobjetos en tolueno (3x durante 5 minutos cada uno) y metanol (3x durante 5 minutos cada uno) bajo una campana extractora. Inhibir las peroxidasas endógenas sumergiendo los portaobjetos en peróxido de hidrógeno al 3% diluido en metanol durante 20 minutos bajo una campana extractora. Enjuagar las diapositivas en destilado (d)H2O(1x durante 3 min). Tinción de inmunofluorescencia multiplexSumerja los portaobjetos en un frasco de tinción de 300 ml que contenga 10 mM de citrato (pH 6) o EDTA (pH 9) complementado con TritonX-100 al 0,1%.NOTA: El tampón utilizado (pH 6 o pH 9) depende del antígeno teñido (ver Tabla 1). Coloque el frasco de tinción con la tapa cerrada en un microondas durante 3-5 minutos a la potencia máxima (por ejemplo, 900 W) hasta que el tampón comience a hervir.NOTA: El momento óptimo para hervir depende del microondas y del volumen del tampón. Los ajustes pueden ser necesarios para encontrar el momento perfecto. Para algunos antígenos frágiles o especímenes frágiles y menos adherentes (por ejemplo, organoides y esferoides), la ebullición por microondas puede ser demasiado dura. En este caso, se puede usar una olla a presión en su lugar. Mantenga el tampón a una temperatura cercana a la ebullición colocando el frasco de tinción cerrado en el microondas a baja potencia (por ejemplo, 90 W) durante 15 minutos. Realice el último paso de calentamiento poniendo el microondas a máxima potencia durante 90 s. Retire el frasco del microondas y deje que el tampón se enfríe durante 15 minutos en RT. Enjuague las diapositivas 3 veces durante 5 minutos cada una en dH2O y 1 vez durante 5 minutos en solución salina tamponada con tris que contenga 0,1% de Tween 20 (TBS-T). Retire el TBS-T secando las diapositivas en una toalla de papel Coloque los portaobjetos (planos) en una bandeja de la cámara de tinción o en una caja portaobjetos para microscopio (consulte la Tabla de materiales). Rodee el tejido con un bolígrafo hidrófobo. Bloquear los sitios de unión no específicos cubriendo el tejido con albúmina sérica bovina (BSA) al 5% disuelta en TBS-T durante 30 min. Retire el amortiguador de bloqueo secando las diapositivas en una toalla de papel.NOTA: No enjuague las diapositivas después del paso de bloqueo. Incubar el tejido durante 60 min con el anticuerpo primario (ver Tabla 1) diluido en BSA TBS-T al 1% cubriendo el tejido con alrededor de 300 μL de la solución. Enjuague las diapositivas 3 veces durante 3 minutos cada una con TBS-T. Incubar el tejido durante 40 min con el anticuerpo secundario poli-HRP (ver Tabla 1) cubriendo el tejido con alrededor de 300 μL de la solución. Enjuague las diapositivas 3 veces durante 3 minutos con TBS-T. Incubar el tejido durante 10 min con reactivo de fluorocromo-tiramida (ver Tabla 1) diluido 200 veces en tampón de borato (borato 0,1 M, pH 7,8, 3 M NaCl) suplementado extemporáneamente con 0,003% deH2O2cubriendo el tejido con alrededor de 300 μL de la solución. Enjuague las diapositivas 3 veces durante 3 minutos con TBS-T. Repita los pasos 1.3.1-1.3.16 hasta que se haya realizado toda la tinción de TSA. Incubar el tejido durante la noche a 4 °C con el último anticuerpo primario (ver Tabla 1) diluido en BSA TBS-T al 1%.NOTA: Dado que la incubación es durante la noche, es importante cubrir la bandeja de la cámara de tinción o la caja de portaobjetos del microscopio y agregar dH2O en una toalla de papel en el fondo de la caja (debajo de los portaobjetos) para asegurarse de que los tejidos no se sequen durante la incubación. Enjuague el pañuelo 3 veces durante 5 minutos cada una con TBS-T. Incubar el tejido durante 120 min con el anticuerpo secundario (acoplado directamente con fluorocromo) diluido 200 veces en BSA TBS-T al 1%. Enjuague el pañuelo 3 veces durante 5 minutos cada una con TBS-T. Tinción de los núcleos incubando el tejido durante 5 min en bisbenzimida (20 mM) diluida 1.000 veces en BSA TBS-T al 10%.NOTA: La bisbenzimida puede ser reemplazada por DAPI, pero este último es más tóxico y debe manejarse con cuidado bajo una campana extractora. Enjuagar el pañuelo 3 veces durante 3 min cada una en dH2O. Monte las guías utilizando un medio de montaje de fluorescencia y vidrios de cubierta de borosilicato. 2. Escaneo de diapositivas Digitalice las diapositivas escaneándolas en un escáner de diapositivas de fluorescencia con un aumento de 20x (los detalles del escáner de diapositivas se proporcionan en la Tabla de materiales).NOTA: En la Figura 1 se muestra un escaneo representativo de un múltiplex óptimo. 3. Análisis de imágenes Importe los escaneos a un software de análisis de imágenes (File > Open Image). Vaya a la pestaña Clasificadores y seleccione el complemento DenseNet AI V2 . Entrene el complemento DenseNet AI V2 para reconocer núcleos rodeando alrededor de 500 núcleos en una imagen. Entrene a la IA en varias otras diapositivas del mismo lote y diferentes lotes de tinción mIF rodeando varios núcleos (50) en varias diapositivas (alrededor de 10).NOTA: Las instrucciones detalladas sobre cómo usar el complemento AI se pueden encontrar en el manual del software. El uso de IA para la detección de núcleos es opcional. Otros métodos para detectar núcleos están disponibles dependiendo del software de análisis de imágenes utilizado. Guarde la IA entrenada (Acciones clasificadoras > Guardar). Vaya a la pestaña Anotaciones y cree una anotación para cada región de interés (ROI), como el centro del tumor y el margen del tumor, mediante la herramienta Anotación de pluma. Si es necesario, elimine las regiones con pliegues y las regiones que aparecen borrosas con la herramienta Anotación de exclusión.NOTA: La tinción con hematoxilina-eosina de una sección adyacente a la utilizada para mIF se puede realizar antes de la tinción mIF para asegurar que las células tumorales estén presentes en la muestra y para ayudar a los anatomopatólogos a determinar el ROI. Vaya a la pestaña Análisis y seleccione el algoritmo HighPlex FL (Acciones de configuración > Cargar > HighPlex FL). Seleccione la pestaña Selección de tinte y seleccione el tinte que le interese. En la pestaña Detección nuclear, vaya a Tipo de segmentación nuclear y seleccione AI custom. En Clasificador de segmentación nuclear, seleccione la IA guardada en el paso 3.5. En la pestaña Detección de membrana y citoplasma, elija el radio máximo de citoplasma (en este estudio, se utilizó 1,5) y el número de colorantes de membrana . Para cada colorante, seleccione el umbral positivo del núcleo, el umbral positivo del citoplasma y el umbral positivo de la membrana.NOTA: El umbral es diferente para cada tinción y debe ajustarse para cada lote de portaobjetos y cada antígeno teñido. El uso de la herramienta Configuración de vista (Ver > Ver configuración) puede ayudar a seleccionar un umbral adecuado utilizando el valor de intensidad al final del pico de intensidad (a la derecha). Para cada colorante, seleccione el núcleo, la membrana y el porcentaje de citoplasma de los valores de completitud.NOTA: Este parámetro es importante para evitar la detección de falsos positivos cuando dos células con tinción diferente están cerca una de la otra (Figura 2). Guarde el algoritmo (Acciones de configuración > Guardar). Analice los ROI (Analyze > Annotation Layer). Vaya a la pestaña Resultados y seleccione todos los datos en Datos de objeto (ctrl + A). Exporte los datos en formato .csv (haga clic con el botón derecho > Exportar datos de > objeto . Csv).NOTA: Esta tabla contiene la posición (Xmin, Xmax; Ymin, Ymax) y la positividad de cada marcador de cada célula analizada. 4. Bioinformática usando R NOTA: Un script R que proporciona más detalles sobre los siguientes pasos está disponible en GitHub (benidovskaya/Ring: Pipeline for the analysis of multiplex immunofluorescence stainings. [github.com]) Usando la tabla exportada, primero defina los diferentes tipos de celdas en función de las tinciones de colocalización. Por ejemplo, defina las células T citotóxicas mediante células CD3+/CD8+ doblemente positivas. A continuación, reconstruya una imagen simplificada de la diapositiva en un diagrama de puntos utilizando las coordenadas exportadas desde el software de análisis de imágenes y ggplot2 (Figura 3). Utilizando estos datos, se pueden realizar varios tipos de análisis:Análisis de densidadNOTA: El análisis más simple es un análisis de densidad.Realice un análisis de densidad para todos los tipos de células utilizando todo el portaobjetos para biopsias o algún área específica del tejido. Por ejemplo, calcule la densidad de las células T CD3+ y CD8+ en el centro del tumor y el margen del tumor (Figura 4A-C). Para calcular esas densidades, utilice un software de análisis de imágenes para producir un marco de datos específico por muestra con el fenotipo y las coordenadas de cada célula. A través de una función de agrupamiento (k-vecino más cercano) en R, cree un objeto poligonal utilizando los bordes de la biopsia estudiada y calcule la densidad de los tipos celulares de interés dentro de ella.NOTA: Esto permite comparar las densidades de diferentes tipos de células entre diferentes condiciones (como diferentes puntos de tiempo, tipos de tratamiento, tipos de tejido y respuesta al tratamiento) y localizaciones (centro del tumor, margen del tumor, fibrosis del estroma y área de necrosis) dependiendo de la hipótesis biológica. Debido a la alta proximidad entre las células cancerosas, las células peritumorales y las células infiltrantes de tumores, el software de análisis de imágenes puede detectar células doblemente positivas como células inmunes y cancerosas al mismo tiempo. En ese caso, uno necesita corregir bioinformáticamente este problema mencionando cuáles son estas células doblemente positivas. En este caso, las células CD3+CD8+citoqueratina+ se marcaron como células citotóxicas porque la positividad de la citoqueratina se debía a las células tumorales que rodean los linfocitos infiltrantes. Mapas de calorUsando la densidad de cada tipo de celda de diferentes paneles y aplicando una normalización (por ejemplo, centrado de escala), dibuje mapas de calor (Figura 5) que representen la abundancia celular en la población de muestras. Mediante el uso de agrupamiento jerárquico no supervisado basado en la densidad celular, agrupe a los pacientes con composiciones similares de EMT y correlacione estos grupos con parámetros clínicos como la respuesta al tratamiento y la supervivencia.NOTA: Los mapas de calor y la agrupación en clústeres se pueden realizar fácilmente con el paquete R ComplexHeatmap9. Distribución celular espacialCalcular bioinformáticamente las distancias entre las células (por ejemplo, células inmunes y tumorales; Figura 6A, B) basadas en las coordenadas de celda proporcionadas por el análisis de imágenes. Utilice las distancias medianas y medias entre los tipos de células de interés para comparar la proximidad celular en todas las muestras de una cohorte. Funciones descriptivas espacialesUtilice la función G-cross del vecino más cercano de tipo cruz, disponible a través del paquete R spatstat10, para determinar la probabilidad de que una célula de interés, X (por ejemplo, una célula tumoral), se encuentre con la célula más cercana, Y (por ejemplo, una célula T), dentro de un cierto radio alrededor de la célula X. Calcular el área bajo la curva empírica para obtener un valor numérico que represente la infiltración tumoral de células T CD3+ alrededor de las células tumorales11 (Figura 6C). Utilice otras funciones descriptivas espaciales como la función F o la función J12. Análisis ImmunoscoreCalcular el Immunoscore (I), desarrollado por el equipo de Galon7,8, utilizando la densidad de células T CD3+ y CD8+ en el centro del tumor y el margen invasivo del tumor.NOTA: La puntuación oscila entre I0 e I4. Una baja densidad de células T CD3+ y CD8+ en el centro y el margen del tumor se asocia con una puntuación de I0, mientras que una alta densidad de células T CD3+ y CD8+ en ambas regiones se asocia con una puntuación de I4. Recientemente, el impacto pronóstico del Immunocore fue validado en un estudio con muestras de 2.681 pacientes con cáncer de colon en estadio I-III de 14 centros en 13 países7. Sin embargo, para ser calculado, Immunoscore requiere una muestra resecada quirúrgicamente que contenga tanto el centro como el margen del tumor. Para las biopsias, que generalmente carecen de margen, recientemente se ha desarrollado un Immunoscore adaptado a la biopsia13. Para calcular el Immunoscore adaptado a la biopsia, convierta el valor de la densidad de células T CD3+ y CD8+ en un percentil y, a continuación, utilice el percentil medio de células T CD3+ y CD8+ para la puntuación en una de tres categorías (es decir, baja, intermedia y alta)13. Análisis de puntos calientesUtilice el análisis de puntos calientes, utilizando la función quadratcount (spatstat)10, para comparar las densidades de diferentes tipos de células en el área más infiltrada del tejido. Por ejemplo, es posible calcular una puntuación “similar a Immunoscore” utilizando el valor de la densidad de células T CD3 y CD8 de los cuadrados más infiltrados del tejido (Figura 7). Aplicar este método para el análisis de cualquier tipo de célula con una distribución no homogénea a través del tejido.