鸡胚胎用于研究卵和离体脑切片共培养物中的人胶质母细胞瘤(GBM)脑肿瘤。GBM细胞行为可以通过离体共培养的延时显微镜记录,并且两种制剂都可以通过详细的3D共聚焦分析在实验终点进行分析。
雏鸡胚胎一直是研究脊椎动物发育的理想模型系统,特别是对于实验操作。雏鸡胚胎的使用已被扩展到研究 体内 人胶质母细胞瘤(GBM)脑肿瘤的形成以及肿瘤细胞对周围脑组织的侵袭性。GBM肿瘤可以通过将荧光标记的细胞悬浮液注射到 蛋中的E5中脑(视顶)脑室中来形成。
根据GBM细胞的不同,紧凑的肿瘤在脑室和脑壁内随机形成,细胞群侵入脑壁组织。可以对带有肿瘤的固定E15 tecta的厚组织切片(350μm)进行免疫染色,以揭示通过共聚焦z-stack图像的3D重建进行分析时,入侵细胞通常沿血管迁移。活E15中脑和前脑切片(250-350μm)可以在膜插入物上培养,其中荧光标记的GBM细胞可以引入非随机位置以提供 离体 共培养以分析细胞侵袭,这也可以沿着血管发生,在大约1周的时间内。这些 离体 共培养可以通过宽场或共聚焦荧光延时显微镜进行监测,以观察活细胞的行为。
然后,可以通过共聚焦显微镜固定,免疫染色和分析共培养的切片,以确定侵袭是否沿着血管或轴突发生。此外,共培养系统可用于研究潜在的细胞间相互作用,方法是将不同细胞类型和颜色的聚集体放置在不同的精确位置并观察细胞运动。药物治疗可以在 离体 培养物上进行,而这些治疗与 卵内 系统不兼容。这两种互补的方法允许在高度可操纵的脊椎动物大脑环境中对人类GBM细胞行为和肿瘤形成进行详细和精确的分析。
癌细胞行为的体外研究通常用于剖析在体内异种移植模型中观察到的更复杂的行为期间操作的潜在机制。例如,对于胶质母细胞瘤(GBM),体外研究揭示了L1CAM在新型鸡胚胎异种移植脑肿瘤模型1,2,3,4,5中肿瘤形成和脑浸润期间潜在运作的机制。尽管体外和体内实验以有用的方式相互补充,但它们在结果如何关联方面留下了很大的差距。例如,培养皿上GBM细胞运动的机制分析是一种高度人工的情况,体内异种移植模型只能揭示肿瘤形成和细胞行为的静态时间点或终点分析。在这些异种移植模型中,使用啮齿动物或小鸡胚胎的体内研究不容易监测细胞行为,而细胞侵入脑组织。然而,雏鸡胚胎异种移植模型已经证明粘附蛋白L1CAM在人T98G GBM细胞的侵袭能力中起刺激作用2,5。
通过使用器官型脑切片培养模型(称为离体模型)桥接体内和体外方法,可以解决这个问题的合适解决方案。在这个离体模型中,活的脑组织可以保持在几百微米的厚度长达几周,从而可以植入癌细胞,随着时间的推移观察它们在实际组织中的行为,然后在实验终点进行更详细的标记分析。
一种流行的器官型切片培养方法是在半透明或透明的多孔膜上培养几百微米厚的脑切片,使组织暴露在空气中,但允许营养培养基从膜下方维持组织(参考Stoppini等人6)。该方法的不同变体已用于不同的研究,包括使用不同的培养基或不同的膜插入物。不同的膜插入物包括直径为30 mm的多孔(0.4 μm)膜插入物,装在35 mm培养皿6中,以及用于6孔板7的细胞培养插入物(0.4 μm)。不同的培养基包括 50% MEM/HEPES + 25% 热灭活马血清 + 25% 汉克斯平衡盐溶液 (HBSS)8、50% 还原血清培养基 + 25% 马血清 + 25% HBSS9 等。如果半透明或透明膜与荧光标记的GBM细胞一起使用,则可以使用倒置宽场或共聚焦荧光显微镜10,11,12,13,14,15从下方成像此类培养物。
虽然许多体内原位脑肿瘤异种移植和离体器官型脑切片培养模型已经使用啮齿动物建立,但如上所述,雏鸡胚胎(Gallus gallus)在这些目的上的利用不足。然而,雏鸡胚胎已被证明能够用作体内原位异种移植模型,用于研究人和大鼠胶质瘤侵袭1,2,5。异种移植细胞进入鸡胚胎大脑表现出与啮齿动物模型中观察到的相似的入侵模式,进一步支持使用鸡胚胎作为GBM肿瘤细胞分析的体内模型。雏鸡胚胎也便宜,比啮齿动物更容易维护(即,在实验室培养箱中的蛋壳中),并且更容易使用,使其成为短期体内GBM研究的有吸引力的选择。最近的一篇文章描述了在正常大脑发育过程中使用小鸡胚胎脑切片培养物形成和生长轴突,其中切片至少存活7天16。然而,缺乏使用这种鸡胚胎脑切片培养物在组织环境中对GBM细胞行为进行离体分析。本文描述了人GBM细胞和GBM干细胞(GSCs)在体内移植到早期鸡胚胎脑中,以及将GBM细胞引入活鸡胚胎脑切片培养物的离体。还提供了从这些制剂中获得的所得肿瘤和细胞侵袭模式的一些代表性实例。
将细胞注射到中脑(视顶)心室方案中的关键步骤包括在注射前和注射期间不损伤卵子中脉络膜尿囊膜或胚胎周围的血管,尽管在将细胞注射到中脑时,可以轻轻拉动并按住胚胎周围的羊膜以定位头部。羊膜比较坚韧,可以用细镊子拉动头部,用一只手保持头部稳定,用另一只手将细胞注射到视顶,视顶是大脑中间的大圆形结构。一般来说,注射胚胎的活力范围从25%到75%,取决于未知因素,实际上每个存活的胚胎在视顶中至少包含一个小肿瘤。生成活脑切片的关键步骤包括吸干组织中多余的液体,以便琼脂糖在切片过程中粘附在大脑上,并保持组织和切片冷,直到放置在膜插入物上。由于不同的细胞类型形成球体的方式不同(速度和大小),因此应针对每种细胞类型优化聚HEMA平板上的接种细胞密度和收获微球之前的时间长度。
这里的工作尚未对脑切片的可行性进行正式的纵向研究。Yang等人使用与此处使用的类似的鸡胚胎脑切片培养物,并显示出切片的良好活力至少7天16。以前的研究表明,当OT组织保存在次优培养基中时,组织中会出现许多pyknotic nucle,而这在本文的工作中的切片中没有发生。此外,当切片在次优条件下退化时,血管碎裂并显示为一排排层粘连蛋白阳性球体(未显示)。因此,尽管尚未通过电生理学或活性半胱天冬酶-3表达等方法检查这里的活力,但在次优培养条件下观察到的细胞死亡指标均未出现。
OT一直专注于体内脑肿瘤实验,因为它是最容易注射的区域,具有最大的心室。在E5,这是胚胎足够小以保持在蛋黄顶部的最新一天,必须将注射注射到心室中,因为所有大脑区域只不过是一个薄的心室区域。然而,这些注射成功地导致嵌入肿瘤,细胞侵入脑实质。有时,在前脑或小脑中发现由此产生的肿瘤,但这并不常见。E15视顶的离体切片主要用于实验,因此离体共培养结果可以与体内注射实验相关联。然而,与视顶相比,前脑切片也适用,并且具有更大的表面积和非常薄的心室,这可能使前脑更适合与体内注射无关的离体共培养。
这里已经证明, 体内 注射,然后进行组织固定,振动组织切片机切片以及层粘连蛋白和其他标志物的免疫染色,从而在靠近血管的脑组织中获得了GBM细胞和GSC的高分辨率图像。通过使用共聚焦软件和制造商的说明从共聚焦光学切片的z堆栈创建3D体积渲染,极大地促进了确定肿瘤细胞和血管之间相互关系的能力。使用GFP,mCherry和DiD标记细胞的宽场荧光显微镜进行延时成像是可能的;然而,靠近高荧光球体的迁移细胞有时会被球体的“辉光”所掩盖。通过仔细调整收集宽场图像的曝光时间,可以在一定程度上将这种不良影响降至最低。使用共聚焦z堆栈随时间变化(4D)的延时成像消除了球体的失焦辉光,并导致具有深色背景的清晰迁移细胞。这在协议中没有描述,但与宽场延时成像类似,宽场延时成像是在6孔塑料板中的透明膜插入物上进行脑切片时进行的。尽管共聚焦延时成像可以明显更清晰地显示单个细胞及其行为的图像,但多点延时实验在20小时内以10分钟的间隔收集10个z平面/点的z堆栈是扫描头振镜的广泛使用。由于这可能会显著缩短电流计的使用寿命,因此应明智地使用此方法。
尽管雏鸡胚胎系统非常适合研究GBM细胞行为的 体内 注射和 离体 共培养实验,但该模型系统存在一些局限性。与任何异种移植系统一样,植入人类细胞的环境不是人脑,但GBM细胞的行为似乎模仿了啮齿动物模型和人类患者的行为。在E5上进行 体内 注射实验后,通常允许肿瘤形成10天,直到E15。这显然不足以研究肿瘤发生和细胞侵袭的各个方面。然而,这里已经证明,实体瘤在脑实质中形成,细胞在肿瘤内相互作用并重新排列,并且在相对较短的时间内沿着血管和弥漫性地发生显着的脑浸润。 体内 雏鸡胚胎系统的另一个限制是它不适合药物或其他治疗,因为在雏鸡胚胎发育过程中运行的大蛋黄和胚胎外循环系统。局部液体药物治疗会导致大脑中高度可变和未知的浓度,因为从胚胎扩散到更大的蛋黄块中。同样,将药物静脉注射到非常脆弱的胚胎外循环系统中会泄漏或扩散出血管,也会导致大脑中未知的浓度。这是采用 离体 切片培养方法的主要原因之一 – 这样不仅可以通过延时显微镜 观察 和跟踪细胞行为,而且可以在更相关的脑组织环境中测试成功改变培养皿4 中GBM细胞行为的治疗。
鸡胚胎原位脑肿瘤模型系统的开发被视为可用于研究GBM肿瘤形成和侵袭性细胞行为的系统和工具的重要补充。受精鸡蛋在大多数地区可能很容易获得,与啮齿动物相比,它们便宜,没有动物护理费用,胚胎非常有弹性和抗感染(即,大多数工作都是在台面上完成的),胚胎具有高度可操纵性,可以在无壳培养物中生长19,雏鸡胚胎不被视为脊椎动物,因此不需要NIH指南的IACUC批准(机构要求)可能会有所不同)。因此,这些多重优势使雏鸡胚胎系统非常有吸引力,如果人们将他们的问题和实验限制在其限制范围内。其他人使用雏鸡胚胎进行了多项GBM细胞研究,但这些研究几乎完全利用了胚胎的绒毛膜尿囊膜(CAM)20,21,22,23,24,25,26,27,28,29和肢芽30,而不是大脑。还有一份报告在E231上将髓母细胞瘤植入小鸡大脑。毫无疑问,使用鸡胚胎作为原位异种移植模型系统,如此处所述,应该产生比使用CAM的研究对人类GBM肿瘤生物学更有意义的结果。
虽然这些研究才刚刚开始充分利用鸡胚胎脑肿瘤模型系统来研究人类GBM细胞和GSC行为,但希望其他研究能够扩展用途并找到进一步的潜在应用。可以想象,该系统不仅会发现调节GBM肿瘤形成和细胞行为的机制,而且还将允许对特定患者细胞上的特定药物和物质进行临床前测试。例如,如果提前建立脑切片培养物,则可以将肿瘤细胞,手术肿瘤切除的碎片或患者来源的GBM类器官32 直接放置在 离体 共培养中,并且可以在几天内评估各种治疗方法。同样,解离的患者细胞可以直接注射到 卵中的 E5中脑中,以评估它们形成肿瘤和侵入脑实质的能力。因此,希望这里对方法和代表性结果的描述将促进和鼓励更多地使用这种高度未充分利用的系统进行脑癌研究。
The authors have nothing to disclose.
这项工作的部分资金来自美国国家癌症研究所(R03CA227312)对DSG的赠款和Lisa Dean Moseley基金会的慷慨资助。活的GBM标本是在患者同意下通过Helen F. Graham癌症中心和研究所的组织采购中心获得的。A.R.的资金由美国国立卫生研究院国家研究资源中心和国家推进转化科学中心(UL1TR003107)提供。N.P.,A.L.,Z.W.和K.S.的暑期本科生研究奖学金由特拉华大学本科生研究计划提供。
1 cm x 1 cm square hole paper punch | Birabira | N/A | |
1 mm biopsy punch pen | Robbins Instruments | 20335 | |
6 well insert plate (Corning Transwell) | Millipore Sigma | CLS3450 | |
9" Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
15 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
24 well plate | Corning Costar | 3526 | |
50 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-539-9 | |
Agar | Fisher BioReagents | BP1423-500 | for embedding fixed brains |
Alexafluor 488-conjugated GAM IgG | Jackson Immunoresearch | 115-605-146 | |
Alexafluor 647-conjugated GAM IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-146 | |
Aluminum foil | ReynoldsWrap | N/A | |
Ampicillin | Sigma Aldrich | A-9518 | |
anti-integrin alpha-6 monoclonal antibody GOH3 | Santa Cruz Biotechnology | sc-19622 | |
anti-L1CAM monoclonal antibody UJ127 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53386 | |
anti-laminin monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
anti-nestin monoclonal antibody 10c2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | |
anti-Sox2 monoclonal antibody E-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365823 | |
B27 supplement without vitamin A | GIBCO | 17504-044 | |
bisbenzimide (Hoechst 33258) | Sigma-Aldrich | B2883 | nuclear stain |
Cell culture incubator | Forma | standard humidified CO2 incubator | |
Centrifuge | Beckman Coulter | ||
Confocal microscope | Nikon Instruments | C2si+ | With custom-made cell incubator chamber |
Confocal microscope objective lenses | Nikon Instruments | Plan Apo lenses, except S Plan Fluor ELWD 20x 0.45 NA objective lens for confocal time-lapse imaging | |
Confocal microscope software | Nikon Instruments | NIS Elements | Version 5.2 |
Curved foreceps | World Precision Intruments | 504478 | |
Curved scissors | Fine Science Tools | ||
Curved spatula | Fisher Scientific | 14-375-20 | |
Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | KG-585 12R | |
D-Glucose | Millipore Sigma | G8270 | |
DiD far red fluorescent dye | Invitrogen | V22887 | Vybrant DiD |
DMEM | Sigma Aldrich | D5671 | |
DMEM/F12 | Sigma Aldrich | D8437 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | |
Dulbecco's Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-1L | |
egg incubator | Humidaire | ||
electrical tape (10 mil thick/254 µm) | Scotch | N/A | |
Ethanol 200 proof | Decon Laboratories | 2701 | |
Fast green FCF dye | Avocado Research Chemicals | 16520 | |
FBS | Gemini Bio-products | 900-108 | |
filter paper | Fisher Scientific | ||
Gauze | Dynarex | 3353 | |
Glass Capillaries for microinjection | World Precision Instruments | TW100-4 | |
Glycerol | Fisher BioReagents | BP228-1 | for mounting media |
GSCs (human glioblastoma stem cells) | Not applicable | Isolated from patient GBM specimens in Galileo laboratory in GSC media and then transduced with a GFP encoding lentiviral vector. Cells used were between passage 10 and 30. | |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-020-CV | |
Hemacytometer | Hausser scientific | ||
Heparin | Fisher Scientific | BP2524-100 | |
HEPES buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
Horse Serum (HI) | Gibco | 26050-088 | |
Human FGF-2 | BioVision | 4037-1000 | |
Human TGF-α | BioVision | 4339-1000 | |
Inverted phase contrast microscope | Nikon Instruments | TMS | for routine viewing of cultured cells |
KCl | Fisher Scientific | BP366 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P284 | |
Laboratory film | Parafilm | ||
Labquake Shaker | LabIndustries | T400-110 | |
L-Glut:Pen:Strep | Gemini Bio-products | 400-110 | |
Low-melt agarose | Fisher Scientific | BP1360 | for embedding live brains |
Matrix | Corning Matrigel | 354234 | |
Medium 199 | GIBCO | 11150-059 | |
MEM | Corning | 10-010-CV | |
Metal vibratome block | |||
Micropipette tips (20, 200, 1,000 µL) | Fisherbrand | ||
Micropipettors (20, 200, 1,000 µL) | Gilson | ||
Microscope Coverglass (no. 1.5 thickness) | Fisherbrand | 12544A | |
NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
NaH2PO4 + H2O | Fisher Scientific | S369 | |
NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328 | |
Normal goat serum | Millipore Sigma | 526-M | |
N-propyl gallate | Sigma Aldrich | P3130 | for mounting media |
Parafilm | Parafilm | ||
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
PBS | Sigma Aldrich | P5493-1L | |
Pencil | |||
Plain Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | |
Plastic 35 mm Petri dish | Becton Dickinson | 351008 | |
pneumatic picopump | World Precision Intruments | PV830 | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (poly-HEMA) | Sigma Aldrich | P-3932 | |
razor blade- double edge | PACE | for cutting fixed brain slices | |
sapphire knife | Delaware Diamond Knives | for cutting live brain slices | |
Scalpel | TruMed | 1001 | |
Sodium cacodylate buffer 0.2 M pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
Specimen chamber for vibratome | custom-made | ||
Stereo Dissecting Microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | Equipped with epifluorescence |
straight foreceps | World Precision Intruments | 500233 | |
straight scissors | Fine Science Tools | ||
Sucrose | Mallinckrodt | 7723 | |
Time-lapse fluorescence microscope (widefield fluorescence) | Nikon Instruments | TE2000-E | With custom-made cell incubator chamber (see Fotos et al., 2006) |
Tissue culture dish polystyrene 100 mm | Thermo Fisher Scientific | 130182 | for cell culturing |
Tissue culture dish polystyrene 60 mm | Becton Dickinson | 353004 | for cell culturing |
Transfer pipette | American Central Scientific Co. | FFP011 | |
Transparent tape | Scotch | ||
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T-8787 | |
Trypsin (0.25%) + 2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
U-118 MG human GBM cell line | ATCC | HTB-15 | Cells were transduced with a lentiviral vector encoding the entire ectodomain sequence of the L1CAM adhesion protein and then with lentiviral vector pUltra-hot encoding mCherry. Passage numbers are unknown. |
Vacuum pump | Cole-Parmer | EW-07532-40 | "Air Cadet" |
Vibrating tissue slicer | Vibratome | 3000 | for cutting live and fixed brain slices |