Здесь мы представляем компиляцию анализов для непосредственного измерения функции митохондрий в клетках млекопитающих независимо от их способности потреблять молекулярный кислород.
Поток электронов в митохондриальной цепи переноса электронов (ETC) поддерживает многогранные биосинтетические, биоэнергетические и сигнальные функции в клетках млекопитающих. Поскольку кислород (O 2) является наиболее распространенным концевым акцептором электронов для внеземных цивилизаций млекопитающих, норма потребления O2 часто используется в качестве прокси для митохондриальной функции. Однако новые исследования показывают, что этот параметр не всегда указывает на функцию митохондрий, поскольку фумарат можно использовать в качестве альтернативного акцептора электронов для поддержания митохондриальных функций при гипоксии. В этой статье собрана серия протоколов, которые позволяют исследователям измерять функцию митохондрий независимо от нормы потребленияO2. Эти анализы особенно полезны при изучении функции митохондрий в гипоксической среде. В частности, мы описываем методы измерения продукции митохондриальной АТФ, биосинтеза пиримидина de novo, окисления НАДН комплексом I и производства супероксида. В сочетании с классическими экспериментами по респирометрии эти ортогональные и экономичные анализы предоставят исследователям более полную оценку функции митохондрий в интересующей их системе.
Функция митохондрий является важнейшим показателем клеточного здоровья, поскольку она поддерживает ключевые биосинтетические, биоэнергетические и сигнальные функции в клетках млекопитающих1. Подавляющее большинство митохондриальных функций требуют потока электронов через цепь переноса электронов (ETC), а нарушения потока электронов в ETC вызывают тяжелое заболевание митохондрий2. ETC состоит из серии реакций восстановления и окисления (окислительно-восстановительных), которые встроены во внутреннюю митохондриальную мембрану, и эти реакции переноса электронов высвобождают свободную энергию, которая может быть использована для поддержки синтеза АТФ, физиологических процессов, таких как термогенез, путей биосинтеза, таких как биосинтез пиримидина de novo, и баланса окислительно-восстановительного статуса кофакторов, таких как НАДН. Комплексы ETC I и III продуцируют активные формы кислорода (АФК)3,4,5, которые, в свою очередь, регулируют ключевые сигнальные пути, такие как HIF, PI3K, NRF2, NFκB и MAPK 6. Следовательно, метрики потока электронов в ETC классически используются в качестве прокси для митохондриальной функции в клетках млекопитающих.
Эксперименты по респирометрии часто используются для измерения функции митохондрий в клетках млекопитающих. Поскольку O2 является наиболее распространенным концевым акцептором электронов для внеземных цивилизаций млекопитающих, его восстановление используется в качестве прокси для митохондриальной функции. Тем не менее, новые данные показывают, что митохондрии млекопитающих могут использовать фумарат в качестве акцептора электронов для поддержания митохондриальных функций, которые зависят от ETC, включая биосинтез пиримидина de novo 7, окислениеNADH 7 и детоксикацию сероводорода8. Таким образом, в определенных контекстах, особенно в гипоксических средах, измерения скорости потребленияO2 (OCR) не дают точного или точного указания на функцию митохондрий.
Здесь мы описываем серию анализов, которые можно использовать для измерения функции митохондрий независимо от OCR. Мы предоставляем анализы для непосредственного измерения комплексного I-опосредованного окисления НАДН, биосинтеза дигидрооротатдегидрогеназы, опосредованного de novo пиримидина, комплексного V-зависимого синтеза АТФ, чистой направленности комплекса сукцинатдегидрогеназы (SDH) и митохондриального происхождения АФК. Эти анализы предназначены для проведения на культивируемых клетках млекопитающих, хотя многие из них могут быть адаптированы для изучения митохондриальных функций in vivo. Примечательно, что анализы, описанные в этом протоколе, являются более прямыми измерениями митохондриальных функций, чем OCR. Кроме того, они позволяют измерять функцию митохондрий при гипоксии, контексте, в котором OCR не является ориентировочным измерением. Взятые вместе, эти анализы в сочетании с классическими экспериментами по респирометрии предоставят исследователям более полную оценку функции митохондрий в клетках млекопитающих.
Поскольку новые исследования показывают, что митохондрии млекопитающих могут функционировать без потребления молекулярного кислорода, для исследователей крайне важно использовать ортогональные анализы, помимо измерений OCR, для точной количественной оценки функции митохондрий. Здесь мы составили серию анализов, которые можно использовать для непосредственной оценки активности комплекса I, комплекса II, комплекса V и DHODH путем измерения митохондриального баланса NAD + / NADH, использования адаптивных концевых акцепторов электронов, производства АТФ, биосинтеза de novo пиримидина и митохондриального АФК. Примечательно, что эти анализы более непосредственно измеряют функцию митохондрий, чем измерения OCR. Кроме того, эти анализы предоставляют исследователям удобные способы количественной оценки функции митохондрий во время гипоксии, для которых измерения OCR в значительной степени не имеют значения из-за того, что фумарат используется в качестве предпочтительного концевого акцептора электронов. Наконец, описанные здесь методы, основанные на пролиферации, более рентабельны, чем классические эксперименты по респирометрии, что обеспечивает широко доступный способ изучения функции митохондрий в системах млекопитающих.
Существуют ключевые соображения при использовании этих анализов для измерения функции митохондрий в культивируемых клетках. Что касается анализов пролиферации, важно скорректировать количество посеянных клеток с учетом скорости удвоения каждой клеточной линии. Клетки должны быть засеяны по крайней мере до 10% слияния и с достаточным пространством, чтобы обеспечить от трех до четырех удвоений, чтобы можно было количественно оценить различия в пролиферации. Еще одним соображением для каждого анализа является концентрация малых молекул, используемых в качестве контроля активности каждого комплекса внеземных цивилизаций. Поскольку разные клеточные линии могут проявлять разную чувствительность к этим ингибиторам, крайне важно проверить дозу этих малых молекул, чтобы определить оптимальную концентрацию.
Универсальным ограничением анализов, изучающих функцию митохондрий in vitro, включая измерения OCR и все описанные здесь анализы, является метаболический состав питательной среды. Стандартная среда для культивирования клеток имеет тенденцию смещать системы к поверхностно высоким уровням функции митохондрий. Например, супрафизиологические уровни глутамина увеличивают его анаплерозцикла TCA 25, который подпитывает синтез митохондриального НАДН и, следовательно, увеличивает окислительное фосфорилирование. Точно так же парциальное давление кислорода колеблется от 3 мм рт.ст. до 100 мм рт.ст. (приблизительно 0,1%-13% O2) в тканях млекопитающих, но является атмосферным (140 мм рт.ст., приблизительно 21%) in vitro26,27. Этот избытокO2 максимизирует дыхательную способность митохондрий и выработку супероксида28. В последнее время были предприняты усилия по разработке культуральных сред, чтобы они были более физиологичными29,30. Примечательно, что культивирование клеток в плазмоподобных средах человека снижает митохондриальное дыхание в некоторых линияхраковых клеток 30, митохондриальные АФК в Т-клетках31 и митохондриальную адаптацию к терапии рака32. Таким образом, очень важно помнить о составе используемых питательных сред и понимать, как это может повлиять на функцию митохондрий.
Другим важным и универсальным ограничением в интерпретации функции митохондрий является возможность различий в количестве митохондрий. Поэтому крайне важно измерять содержание митохондрий либо путем количественного определения мтДНК33, либо измерения массы митохондрий с помощью нечувствительных к потенциалу мембранных красителей34, либо вестерн-блоттинга митохондриальных маркеров. Это критический контроль, чтобы уменьшение количества митохондрий не было ошибочно принято за снижение функции митохондрий.
Существуют также определенные ограничения и устранение неполадок, которые применяются к описанным здесь анализам. Во-первых, учитывая, что дифференцированные клетки не размножаются, анализы, основанные на пролиферации, не будут полезны для оценки функции митохондрий в этом контексте. Ключевым ограничением протокола отслеживания 13C 4-аспартата для измерения активности DHODH является то, что поглощение аспартата в клетках может быть крайне неэффективным35. Чтобы преодолеть это потенциальное ограничение, исследователи могут сверхэкспрессировать транспортер аспартата, SLC1A3, чтобы облегчить поглощение 13C 4-аспартата35.
Ограничением протокола, использующего отслеживание 13C 5-глутамина для измерения активности SDH, является то, что этот анализ требует, чтобы клетки использовали восстановительный путь карбоксилирования для обогащения изотопологов M + 3 для измерения обратной активности. Некоторые клеточные линии не способны к восстановительному потоку карбоксилирования из-за низкой экспрессии цитратлиазыАТФ 36, недостаточной стабилизации HIF37 или слишком низкого соотношения α-кг к цитрату38. Чтобы преодолеть это ограничение, можно использовать трассировку 13C 4-аспартата для измерения прямой и обратной активности SDH7. В этом анализе прямую активность SDH можно измерить по соотношению фумарата M + 2: сукцинат M + 2, а обратную реакцию сукцината M + 4: фумарат M + 4. Примечательно, что это отслеживание обходит большинство ферментов в пути восстановительного карбоксилирования.
Ограничением анализа активности комплекса I с использованием сокращения DCPIP в качестве считывания является то, что митохондрии не являются структурно неповрежденными. Процесс замораживания-оттаивания митохондрий для обеспечения их поглощения НАДН для анализа, безусловно, может запятнать структурную целостность митохондриальной мембраны39. Этот анализ следует проводить параллельно с такими анализами, как анализ пролиферации комплекса I, чтобы убедиться, что наблюдаемые изменения активности комплекса I также верны для интактных клеток.
В будущих исследованиях некоторые из этих методов могут быть адаптированы для измерения митохондриальных функций in vivo с использованием модельных организмов, таких как мыши и Caenorhabditis elegans. Современные методы, используемые для измерения функции митохондрий in vivo, сосредоточены на OCR на уровне организма, в частности, на скорости дыхательного обмена при использовании мышиных моделей. Явным ограничением этого метода является то, что кислород выполняет множество биохимических и сигнальных функций, помимо своей роли вездесущего концевого акцептора электронов в митохондриальных ETC. Например, кислород «потребляется» каталитической активностью ферментов семейства диоксигеназ. Хотя эти ферменты вносят свой вклад в скорость потребления кислорода клетками, они не участвуют, не регулируют и не отражают функцию митохондрий. Классические эксперименты по респирометрии in vitro обычно контролируют «немитохондриальное OCR», тогда как эксперименты с коэффициентом дыхательного обмена организма (RER) не могут контролировать это, ограничивая интерпретацию RER как метрики митохондриальной функции in vivo. Тем не менее, можно адаптировать протоколы для измерения активности DHODH с помощью отслеживания 13 C 4-аспартата, активности комплекса II с помощью отслеживания 13C5-глутамина, активности комплекса I в митохондриях, очищенных от тканей, и митохондриальных АФК с использованием дружественных к LC-MS соединений, таких как MitoB, для измерения функции митохондрий in vivo . Эти прямые анализы для опроса митохондриальных функций в сочетании с классическими экспериментами по респирометрии предоставляют исследователям более полную и точную оценку функции митохондрий в клетках и тканях млекопитающих.
The authors have nothing to disclose.
Фигуры, представленные в этой рукописи, были созданы с помощью BioRender.com. Мы благодарны Эми Уокер за отзыв об этой статье. J.B.S. был поддержан грантом Вустерского фонда биомедицинских исследований.
1.5 mL tube | Cell Treat | 667443 | |
2.0 mL tube | Cell Treat | 229446 | |
6-well plate | Cell Treat | 229106 | |
12-well plate | Cell Treat | 229112 | |
13C4-aspartate | Sigma-Aldrich | 604852 | |
13C5-Glutamine | Cambridge Isotope Laboratories | 285978-14-5 | |
15 mL centrifuge tube | Cell Treat | 667411 | |
50 mL centrifuge tube | Cell Treat | 667421 | |
150 mm tissue culture dish | Cell Treat | 229651 | |
1x Phosphate-buffered saline | Gibco | 10010049 | |
2,6-dichlorophenolindophenol | Honeywell | 33125 | |
Ammonium Carbonate | Sigma-Aldrich | 37999 | |
Antimycin | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Ascentis Express C18 | Sigma-Aldrich | 53825-U | |
Bottle top filter 500 mL, 0.22 µm, PES 9 9 mm membrane diameter | Cell Treat | 229717 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
Brequinar | Sigma-Aldrich | SML0113 | |
Cell Lifter, Double End Flat and Narrow Blade | Cell Treat | 229305 | |
CentriVap -105 Cold Trap | Labconco | 7385020 | |
Complete Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
Coulter Counter Cups | Fisher Scientific | 07-000-694 | |
Decylubiquinone | Sigma-Aldrich | D7911 | |
DMSO | Invitrogen | D12345 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Eppendorf Centrifuge 5425R | Eppendorf | 2231000908 | |
Eppendorf Centrifuge 5910 Ri | Eppendorf | 5943000343 | |
Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
Glucose-free DMEM | Gibco | 11966025 | |
Glutamine-free DMEM | Thermo Fisher | 11960044 | |
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
HPLC-grade 35% Ammonium hydroxide | Thermo Scientific | 460801000 | |
HPLC-grade Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 900667 | |
HPLC-grade Chloroform | Sigma-Aldrich | 366927 | |
HPLC-grade formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
HPLC-grade Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935 | |
HPLC-grade MeOH | Sigma-Aldrich | 900688 | |
HPLC-grade Water | Sigma-Aldrich | 270733 | |
Human Osteosarcome Cell Line 143B | ATCC | CRL-8303 | |
Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331-500ML | |
Isotone buffer | Beckman Coulter | 8546719 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P2222 | |
Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
MitoSox Red | Invitrogen | M36008 | |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
Pencillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Potter-Elvehjem Tissue Grinder, Size 21 | Kimble | 885502-0021 | |
Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
Pyruvate-free DMEM media | Gibco | 11965175 | |
Q Exactive Plus Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 726030 | |
ReCO2ver Incubator | Baker | ||
Refrigerated Centrivap Benchtop Vacuum Concentrator | Labconco | 7310020 | |
RIPA Buffer | Millipore Sigma | 20188 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
SeQuant ZIC-pHILIC 5μm 150 x 2.1 mm analytical column | Sigma-Aldrich | 1.50460.0001 | |
SeQuant ZIC-pHILIC guard kit | Millipore Sigma | 1.50438.0001 | |
Sodium Hydroxide, Pellets | Millipore Sigma | 567530-250GM | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
SW, TRACEFINDER 5.1 SP3 | Thermo Scientific | OPTON-31001 | |
Tert-butyl hydroperoxide solution | Sigma-Aldrich | 458139 | |
Tris | Sigma-Aldrich | 93352 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25-200-114 | |
Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | |
VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC | Thermo Scientific | VF-S01-A-02 | |
Z2 Coulter Particle count and size analyzer | Beckman Coulter | BZ10131270 |