Tests indépendants de l’oxygène pour mesurer la fonction mitochondriale chez les mammifères

1. Essais de prolifération pour mesurer l’activité du complexe I, de la dihydroorotate déshydrogénase (DHODH) et du complexe V Cellules d’ensemencement pour les essais de proliférationREMARQUE : Ce protocole utilise la lignée cellulaire d’ostéosarcome humain 143B achetée dans le commerce auprès de l’ATCC. Cette lignée cellulaire a été utilisée conformément aux lignes directrices de notre protocole approuvé par le Comité de biosécurité (CIB) de l’établissement.Retirez les plaques de l’incubateur de culture tissulaire. Aspirer le milieu des assiettes et laver avec 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer tout milieu restant. Aspirer le PBS et couvrir le plat avec 0,05% -0,25% de trypsine pour soulever les cellules du fond de la plaque. Attendez 3 à 5 minutes que la trypsine libère les cellules de la plaque, puis éteignez la trypsine avec 10 ml du milieu de croissance désiré contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS). Recueillir les cellules dans un tube conique et centrifuger à 1 000 × g pendant 5 min pour granuler les cellules. Aspirer le milieu du tube sans déranger la pastille. Remettez la pastille en suspension avec un milieu complet. Comptez les cellules et quantifiez le volume nécessaire pour ensemencer entre 10 000 et 25 000 cellules dans une plaque à 6 puits.REMARQUE: Chaque lignée cellulaire devra être optimisée pour le nombre de cellules à ensemencer. La confluence idéale atteinte est ~10% au début de l’expérience et ~80% à la fin de l’expérience. Pipeter les cellules dans une plaque de 6 puits, et ajouter 2 mL de milieu complet dans les puits. Laisser reposer pendant 24 h avant de passer aux conditions du milieu expérimental.REMARQUE : Ensemencer au moins trois répétitions par affection et suffisamment de puits pour tester la condition témoin non traitée, la condition témoin traitée par inhibiteur, la condition expérimentale non traitée et la condition expérimentale traitée par inhibiteur. Changement moyen pour évaluer l’activité complexe V par proliférationNOTE: Les cellules proliférant dans un milieu avec du galactose dépendent de l’activité du complexe V pour la synthèse de l’ATP 9,10. Contrairement au glucose, qui produit deux ATP nets de glycolyse, le galactose n’en produit aucun, forçant les cellules à dépendre du complexe V pour la synthèse de l’ATP (Figure 1). L’inhibiteur complexe V oligomycine est utilisé comme témoin.Fabriquer un milieu contenant du glucose de 10 mM (voir tableau 1). Fabriquer un milieu contenant du galactose à 10 mM (voir tableau 1). Changez le milieu dans chaque puits pour du DMEM contenant du glucose ou du DMEM contenant du galactose. Ajouter 5 μM d’oligomycine (l’inhibiteur complexe V) aux puits concernés et le même volume de DMSO aux puits non traités. Le stock d’oligomycine est de 10 mM remis en suspension dans du DMSO. Remettez la plaque dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 2 jours. Changement moyen pour évaluer l’activité complexe I par proliférationNOTE: Les cellules proliférant dans un milieu exempt de pyruvate dépendent davantage de l’activité du complexe I11,12. Sans pyruvate, les cellules cultivées nécessitent le complexe I pour faciliter la majeure partie de la réoxydation du NADH en NAD+ (Figure 2). L’inhibiteur du complexe I roténone est utilisé comme témoin.Faire un milieu DMEM sans pyruvate complété avec 10% FBS et 1% pénicilline-streptomycine. Préparer une solution 1 M de pyruvate (voir tableau 1). Changer le milieu dans chaque puits pour un milieu exempt de pyruvate ou un milieu contenant du pyruvate. Ajouter 2 μM de roténone (l’inhibiteur du complexe I) aux puits traités et le même volume de DMSO aux puits non traités. Le stock de roténone est de 25 mM remis en suspension dans du DMSO. Remettez la plaque dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 2 jours. Changement moyen pour évaluer l’activité de la DHDH par proliférationNOTE: Les cellules proliférant dans un milieu sans uridine nécessitent une activité dihydroorotate déshydrogénase (DHODH)11,12,13. En l’absence d’uridine exogène, les cellules cultivées synthétisent les pyrimidines par la voie de novo. L’inhibiteur de DHODH brequinar est utilisé comme témoin.Faire du DMEM sans uridine complété par 10% FBS et 1% de pénicilline-streptomycine. Préparer une solution mère d’uridine à 10 mg/mL, puis préparer un milieu uridine à 100 μg/mL (voir le tableau 1). Changer le milieu dans chaque puits pour un milieu exempt d’uridine ou un milieu contenant de l’uridine. Ajouter 5 μM de brequinar (l’inhibiteur de DHODH) aux puits traités et le même volume de DMSO aux puits non traités. Le stock de brequinar est de 10 mM remis en suspension dans le DMSO. Remettez la plaque dans l’incubateur de culture tissulaire pendant 2 jours. Compter les cellules pour les essais de proliférationPour toutes les expériences, reconstituez le milieu tous les 2 jours. Si le milieu devient de couleur jaune, augmentez la fréquence des changements de milieu. Laissez les cellules proliférer jusqu’à 7 jours et arrêtez l’expérience si l’un des puits commence à sembler envahi par la végétation. Les puits sont considérés comme envahis lorsque la confluence dépasse 80%. Aspirer le milieu, laver avec 1x PBS et couvrir le fond du puits avec 0,25% de trypsine (500 μL pour un plat à 6 puits). Attendez 5 minutes jusqu’à ce que les cellules aient décollé du plat. Vérifiez cela au microscope. Tremper la trypsine avec 1 mL de DMEM complet contenant 10% de FBS. Pipette de haut en bas pour briser les amas de cellules. Préparer les gobelets Coulter en remplissant chacun avec 10 ml de tampon isotone (une tasse par puits). Comptez les cellules d’un compteur de cellules et enregistrez les données. Si la lecture est le nombre de cellules par millilitre (cellules/mL), multipliez la valeur enregistrée par 1,5 pour obtenir le nombre total de cellules par puits.REMARQUE: D’autres méthodes de comptage cellulaire telles qu’un hémocytomètre suffiront si le laboratoire ne dispose pas d’un compteur Coulter. 2. Tracédes isotopes stables en C 4-aspartate et analyse LC-MS pour mesurer l’activité DHODH 13Tracé des isotopes stables en C 4-aspartate dans les cellules adhérentesNOTE: L’activité DHODH peut être directement surveillée en mesurant l’incorporation de 13 C 4-aspartate dans 13C3-UMP. Brequinar est utilisé comme témoin de l’activité DHODH (figure 3). Les niveaux résultants de 13C3-UMP sont une mesure de l’activité DHODH.Ensemencez entre 250 000 et 500 000 cellules dans un plat à 6 puits pour atteindre 75% de confluence le lendemain. Préparer une solution mère de milieu 250 mM 13 C 4-aspartate et 10 mM 13C4-aspartate (voir tableau 1). Changer le milieu dans chaque puits en milieu contenant 10 mM 13C 4-aspartate. Incuber pendant le nombre d’heures approprié pour obtenir un état stable pour marquer les cellules d’intérêt.NOTE: L’état d’équilibre est défini comme la période dans laquelle le pourcentage de métabolite marqué plafonne au fil du temps14. Pour les cellules d’ostéosarcome 143B, le 13C 4-aspartate atteint un état d’équilibre à 8 heures. Il est préférable de déterminer ce délai avant l’expérimentation en effectuant une expérience sur le parcours temporel avec l’isotope stable d’intérêt. Isolement du métabolite des cellules adhérentesAvant de commencer, préparez un seau de glace sèche et préparez 80% de MeOH de qualité CLHP dans de l’eau de qualité CLHP. Refroidissez ce tampon dans un congélateur à -80 °C pendant une nuit ou placez-le directement sur de la glace sèche. Sortir une assiette à la fois de l’incubateur, aspirer le milieu des puits et laver 2x avec 1x PBS. Retirez tout le PBS résiduel des puits avant de passer à l’étape suivante.REMARQUE: Assurez-vous d’incliner la plaque pendant l’aspiration et la pipette contre la paroi de la capsule pour éviter la perturbation des cellules adhérentes. Placez la plaque sur de la glace sèche et ajoutez immédiatement 800 μL de MeOH de qualité LCMS à 80 % dans de l’eau de qualité LCMS à 20 % dans chaque puits. Incuber la plaque pendant au moins 15 minutes dans un congélateur à −80 °C pour faciliter la lyse cellulaire.REMARQUE: À ce stade, la plaque suivante peut être retirée de l’incubateur et les étapes 2.2.1-2.2.4 répétées. Continuez jusqu’à ce que toutes les plaques soient en incubation dans le congélateur à −80 °C. Sortir une assiette à la fois du congélateur, gratter chaque puits sur de la glace sèche à l’aide d’un élévateur de cellule et transférer le lysat dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Gardez le tube sur de la glace sèche jusqu’à l’étape suivante. Vortex de tous les tubes pendant 10 min à 4 °C, puis centrifugation à 4 °C pendant 10 min à la vitesse maximale (au moins 17 000 × g). Transférer le surnageant dans un tube à microcentrifugation de 1,5 mL et sécher dans un concentrateur sous vide à 4 °C équipé d’un piège à froid à −105 °C sous vide poussé pendant environ 6 h ou jusqu’à ce que les échantillons se soient évaporés. Une fois le lysat séché, conservez les pastilles de métabolite à -80 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être préparées pour la chromatographie liquide associée à la spectrométrie de masse (LCMS). Mesure par chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) des métabolites polairesNOTE: Tout flux de travail chromatographique et spectrométrie de masse permettant la détection de l’aspartate, des intermédiaires dans la biosynthèse de novo de la pyrimidine et de l’UMP suffira14.Préparer les échantillons pour le LCMS sur glace en ajoutant 100 μL d’eau de qualité CLHP aux granulés séchés et au vortex pendant 10 minutes à 4 °C. Centrifuger les échantillons à 4 °C pendant 10 min à la vitesse maximale (au moins 17 000 × g) et déplacer 25 μL dans chaque flacon de LC-MS. Injecter 2 μL de lysat dans le système LC-MS. Une méthodologie couramment utilisée est donnée ci-dessous:Préparer la phase A mobile comprenant 20 mM de carbonate d’ammonium (qualité LC-MS) et 0,1 % d’hydroxyde d’ammonium (qualité LC-MS) dissous dans de l’eau de qualité LC-MS. Choisissez 100% acétonitrile (LC-MS Grade) comme phase mobile B. Pour la chromatographie, choisissez une colonne analytique de 5 μm, 150 mm x 2,1 mm équipée d’une colonne protectrice de 2,1 mm x 20 mm pour les composés hydrophiles (voir le tableau des matériaux). Régler le four à colonne à 25 °C. Utilisez les paramètres de chromatographie liquide suivants : un débit constant de 0,15 mL/min; un gradient linéaire de 80 % à 20 % de la phase B mobile pendant 20 min, suivi d’un gradient linéaire de 20 % à 80 % de la phase B mobile pendant 0,5 min, suivi d’un maintien à 80 % de la phase B mobile pendant 7,5 min. Choisissez les réglages suivants du spectromètre de masse : un balayage complet entre m/z 70 Da et 1 000 Da ; une résolution de 70 000 personnes; un objectif AGC de 1 × 106; et un temps d’injection maximal de 20 ms. Faites fonctionner la source en mode de commutation de polarité. Réglez la tension de pulvérisation à 3,0 kV, le capillaire chauffé à 275 °C, la sonde HESI à 350 °C, le débit de gaz de gaine à 40 unités, le débit de gaz auxiliaire à 15 unités et le débit de gaz de balayage à 1 unité. Effectuez l’analyse des données à l’aide de n’importe quel logiciel qui s’interface avec le flux de travail LCMS.REMARQUE: Les logiciels utilisés avec le flux de travail ci-dessus sont XCalibur (Thermo) et TraceFinder (Thermo). Les principales considérations relatives à l’analyse des données sont décrites ci-dessous :Temps de rétention prévus : Déterminer le temps de rétention de chaque métabolite en exécutant les étalons pour chaque métabolite d’intérêt en utilisant la méthode chromatographique avant l’expérience.Remarque : Les temps de rétention de l’UMP et de ses isotopologues, y compris 13C3-UMP, sont exactement les mêmes. M/Z attendu pour les métabolites : Si un métabolite s’ionise en mode ion négatif (tel que UMP), calculer la masse exacte attendue en utilisant la formule moléculaire de UMP moins un proton [C 9 H14N2O9P]. Pour les métabolites qui s’ionisent en mode ion positif, calculez la masse exacte en utilisant la formule moléculaire plus un proton. Précision de masse: Lors de l’utilisation d’un spectromètre de masse orbitrap, le métabolite d’intérêt et ses isotopologues devraient avoir une précision de masse de ±5 mmu. Utilisez un logiciel pour calculer cela, en tenant compte du M/Z attendu et du M/Z réel détecté. Correction de l’abondance naturelle : Toutes les données de traçage devraient subir une correction de l’abondance naturelle pour tenir compte des isotopes ~1 % 13C et ~0,5 % 15 N-isotopes dans la nature 15. 3. Tracédes isotopes stables de la5-glutamine en C pour mesurer l’activité de la SDH 13Tracé des isotopes stables en C 5-glutamine dans les cellules adhérentesNOTE: L’activité SDH peut être directement surveillée en mesurant l’interconversion de certains isotopologues du fumarate et du succinate sur 13C5-glutamine traçant 7,16,17. L’inhibiteur du complexe III, l’antimycine, est utilisé comme témoin pour modifier la directionnalité nette du complexe SDH (Figure 4).Ensemencez entre 250 000 et 500 000 cellules dans un plat à 6 puits pour atteindre 75% de confluence le lendemain. Préparer un stock de 50 mM 13C5-glutamine (voir tableau 1). Préparer un milieu calque contenant 2 mM 13C5-glutamine (voir tableau 1). Changer le milieu dans chaque puits en milieu contenant 2 mM 13C5-glutamine. Incuber pendant le nombre d’heures approprié pour obtenir un état stable de marquage des cellules d’intérêt (voir la note à l’étape 2.1.3). Isoler les métabolites en suivant le protocole de l’étape 2.2. Analysez les échantillons sur LC-MS en suivant le flux de travail décrit à l’étape 2.3. Analyse de l’activité SDH basée sur les modèles d’étiquetageNOTE: L’activité d’oxydation du succinate du complexe SDH peut être surveillée en évaluant le rapport de 13 C 4-fumarate à 13C4-succinate sur 13 C5-glutamine traçage. L’activité de réduction du fumarate du complexe SDH peut être surveillée en évaluant le rapport de 13 C 3-succinate à 13 C3-fumarate sur 13C 5-glutamine traçage.Calculez le pourcentage d’étiquetage de 13 C 3-fumarate, 13 C 4-fumarate, 13 C3-succinate et 13C 4-succinate. Par exemple, pour déterminer le pourcentage de fumarate de 13 C3, additionnez toutes les aires de pics intégrées pour les isotopologues du fumarate (fumarate non marqué, fumarate 13 C1, fumarate 13C 2, fumarate 13 C 3 et fumarate 13 C4), et divisez l’aire de pic pour 13C 3-fumaratepar la surface isotopologique totale. Multipliez par 100. Pour calculer l’oxydation du succinate de succinate divisez le pourcentage de fumarate de 13C 4 par le pourcentage de 13C4-succinate. Pour calculer la réduction du fumarate, diviser le pourcentage de 13 C 3-succinate par le pourcentage de fumarate de 13C 3. 4. Essai direct de l’activité complexe I NOTE: DCPIP est un accepteur d’électrons artificiel; Il change de forme réduite lorsqu’il accepte les électrons de l’ubiquinol. Dans ce test, l’ubiquinone est réduite en ubiquinol via l’oxydation complexe médiée par l’I du NADH en NAD+. Ainsi, la mesure du renouvellement du DCPIP oxydé dans ce test acellulaire est une approximation de l’activité du complexe I 7,18. Purifier et quantifier les mitochondries des cellulesREMARQUE: Tout protocole de purification mitochondriale peut être utilisé pour ce test19.Développez les cellules jusqu’à ce que 25 à 100 millions de cellules soient obtenues. Aspirer le milieu de la vaisselle, laver avec 1x PBS, aspirer le PBS et essayer de faire tourner les cellules avec 0,25% de trypsine. Tremper la trypsine avec un milieu de culture et granuler les cellules à 1 000 × g pendant 5 min. Laver les granulés de la cellule 2x dans 5 ml de 1x PBS, et répéter la centrifugation à 1 000 × g pendant 5 min pour granuler les cellules. Conservez les granulés lavés dans un congélateur à −20 °C jusqu’à purification mitochondriale.REMARQUE : Ne pas congeler-décongeler les granulés de la cellule plus d’une fois. Préparer le tampon d’isolement des mitochondries (voir Tableau 1).NOTE: Les réactifs contenant du sodium tels que NaOH ne doivent pas être utilisés pour préparer des tampons d’isolement mitochondrial, car le sodium ternit le potentiel de la membrane mitochondriale20 et perturbe l’homéostasie mitochondrialedu calcium 21. Remettez en suspension les granules cellulaires à 10 millions de cellules par 1 mL de tampon d’isolement mitochondrial. Par exemple, remettre en suspension 100 millions de cellules granulées dans 10 ml de tampon d’isolement mitochondrial.REMARQUE: Assurez-vous de perturber les amas de cellules sans introduire de bulles dans le tampon. Déplacez 2 mL de suspension cellulaire dans un homogénéisateur en verre prérefroidi d’un volume de travail de 3 à 8 mL compatible avec un pilon PTFE Potter-Elvehjem. Homogénéiser les cellules avec 10-20 coups, en surveillant les cellules au microscope pour confirmer la lyse cellulaire tout au long du processus d’homogénéisation. Augmentez le nombre d’AVC si nécessaire pour assurer une lyse cellulaire efficace.REMARQUE: Si l’homogénéisation des cellules avec la méthode ci-dessus n’est pas efficace pour lyser les cellules, passez à une méthode de lyse à la seringue22. Transférer 2 mL du lysat cellulaire dans un tube microcentrifuge sur de la glace et répéter les étapes ci-dessus jusqu’à ce que la suspension cellulaire entière soit homogénéisée. Enduire les noyaux et les débris cellulaires à 650 × g pendant 10 min dans une centrifugeuse à 4 °C. Déplacer le surnageant dans un nouveau tube de 2,0 ml et répéter la centrifugation ci-dessus à 650 × g pendant 10 min à 4 °C. Déplacer le surnageant dans un nouveau tube de 2,0 ml et enduire les mitochondries brutes à 7 000 × g pendant 10 minutes dans une centrifugeuse à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de tampon d’isolement mitochondrial. Déplacez 50 μL dans un nouveau tube pour la quantification des protéines. Répétez l’étape de centrifugation ci-dessus sur les deux aliquotes de l’échantillon (l’échantillon de 50 μL et les ~950 μL restants). Jeter le surnageant et conserver les granulés dans un congélateur à −80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être utilisés. Ajouter 200 μL de tampon RIPA aux pastilles de l’aliquote de 50 μL pour extraire la protéine, vortex pendant 10 minutes et centrifuger à 21 000 × g pour isoler la protéine. Quantifier la quantité de protéines dans l’aliquote de 50 μL et utiliser ce nombre pour quantifier la protéine restante dans l’échantillon de 950 μL. Par exemple, si la quantification de la protéine pour la partie aliquote de 50 μL est de 1 μg/μL, la protéine totale dans la pastille mitochondriale restante est de 950 μg (1 μg/μL × 950 μL). Réalisation du test d’activité complexe IREMARQUE: La lignée cellulaire d’ostéosarcome 143B a été utilisée pour ce test, mais le protocole peut être adapté à toutes les cellules en culture.Resuspendre les mitochondries purifiées dans le tampon de remise en suspension des mitochondries (voir tableau 1) à une concentration finale de 5 mg de protéines/mL. Effectuer cinq cycles de congélation/décongélation dans un congélateur à −20 °C pour perméabiliser les mitochondries. Faire tampon pour l’essai d’activité complexe I (voir tableau 1). Mélanger 50 ug du stock de mitochondries de 5 mg/mL avec 90 μL de tampon d’activité complexe I. Préparer cinq répétitions non traitées et cinq répétitions traitées à la roténone (5 μM) pour contrôler l’activité complexe I. Lire l’absorbance de base à 600 nm dans un lecteur de plaques réglé à 37 °C. Initier la réaction en ajoutant du NADH à une concentration finale de 2 mM et suivre l’absorbance (600 nm) sur une période de 1 h, en mesurant au moins toutes les 2 minutes tout au long. La diminution de l’absorbance est révélatrice d’une réduction du DCPIP via l’activité du complexe I.REMARQUE: Le NADH doit être ajouté à l’aide d’une pipette multicanal pour s’assurer que tous les échantillons sont initiés en même temps. 5. Dosage à base de LC-MS pour mesurer les niveaux de superoxyde REMARQUE: Les propriétés de fluorescence de MitoSox Red peuvent changer indépendamment de sa réaction avec le superoxyde23. Ce test basé sur LC-MS mesure directement le produit à partir du superoxyde réagissant avec MitoSox Red. Le test suivant est légèrement modifié par rapport à Xiao et al.24. Le 2-hydroxy-mitoethidium (2-OH MitoE2+) est le produit de la réaction superoxyde (Figure 5). La lignée cellulaire Caki1 a été utilisée pour ce test, mais le protocole peut être adapté à toutes les cellules en culture. Traitement des cellules adhérentes avec MitoSox RedEnsemencez entre 250 000 et 500 000 cellules dans un plat à 6 puits pour atteindre 75% de confluence le lendemain. Assurez-vous d’ensemencer un ensemble de plaques pour le test LC-MS et un jeu de plaques en double pour la normalisation du nombre de cellules. Préparer du DMEM complet contenant 10 % de FBS inactivé par la chaleur et 1 % de pénicilline-streptomycine dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco. Rafraîchir le milieu dans tous les puits pour toutes les conditions avec 2 mL de DMEM complet. Assurez-vous d’ajouter des médicaments ou des traitements d’intérêt à ce stade. Incuber les cellules dans un incubateur de culture tissulaire pendant 1 h. Préparez des contrôles positifs et négatifs. Préparer un stock de 50 mM d’hydroperoxyde de tert-butyle dilué dans du PBS et un stock de 250 mM de N-acétylcystéine (NAC) dilué dans du DMSO (voir le tableau 1).REMARQUE: L’hydroperoxyde de tertbutyle (tBuOOH) est une espèce réactive puissante de l’oxygène qui agira comme un contrôle positif et augmentera la quantité de 2-OH MitoE2+. La NAC est un puissant antioxydant qui agira comme un contrôle négatif et neutralisera la production de superoxyde causée par tBuOOH. Ajouter 1 μL de tBuOOH aux puits témoins positifs et 1 μL de tBuOOH + 100 μL de NAC aux puits témoins négatifs.REMARQUE: L’utilisation d’une pipette P2 (plage de 0,1 à 2 μL) est la meilleure façon de transférer 1 μL. Incuber pendant 1 h dans un incubateur de culture tissulaire. Préparer 1 mM de MitoSox Red (voir Tableau 1) et ajouter 2 μL de MitoSox Red 1 mM à chaque puits pour obtenir une concentration finale de 1 μM. Incuber pendant 30 min dans un incubateur de culture tissulaire. Au cours de cette incubation finale, compter l’une des plaques dupliquées pour acquérir le nombre de cellules afin de normaliser les données finales de LC-MS. Isolement du produit Mitosox Red oxydé des cellules adhérentesProcurez-vous un seau de glace sèche et placez de l’isopropanol frais de qualité CLHP sur la glace sèche avant de commencer l’isolement. En sortant une assiette à la fois, aspirez le milieu des puits et lavez 2x avec 1 mL de 1x PBS. Aspirez tout le PBS résiduel des puits avant de passer à l’étape suivante.REMARQUE: Assurez-vous d’incliner la plaque pendant l’aspiration et la pipette contre la paroi de la capsule pour éviter toute perturbation des cellules adhérentes. Placez la plaque sur de la glace sèche et ajoutez 800 μL d’isopropanol de qualité CLHP à chaque puits. Incuber la plaque pendant au moins 15 minutes dans un congélateur à −80 °C pour faciliter la lyse cellulaire.REMARQUE: À ce stade, la plaque suivante peut être retirée de l’incubateur et les étapes 5.2.1-5.2.4 répétées. Continuez jusqu’à ce que toutes les plaques soient en incubation dans le congélateur à −80 °C. Sortir une assiette à la fois du congélateur, gratter chaque puits sur de la glace sèche à l’aide d’un élévateur de cellule et transférer le lysat dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Gardez le tube sur de la glace sèche jusqu’à l’étape suivante. Vortex de tous les tubes pendant 10 min à 4 °C, puis centrifugation à 4 °C pendant 10 min à la vitesse maximale (au moins 17 000 × g). Transférer le surnageant dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL et sécher dans un concentrateur sous vide. Une fois le lysat séché, conservez les granulés de métabolite à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour la LC-MS. Mesure LC-MS du MitoSox Red et du 2-hydroxy-mitoethidium (2-OH MitoE2+)Préparer les échantillons pour le LCMS sur glace en ajoutant 100 μL d’un mélange 3:3:1 de MeOH:chloroforme:eau de qualité CLHP. Vortex pendant 10 min à 4 °C. Déplacez 25 μL dans chaque flacon de LC-MS. Conservez le reste de l’échantillon dans le congélateur à −80 °C. Préparer les tampons de chromatographie liquide suivants : i) tampon A : eau de qualité CLHP contenant 0,1 % d’acide formique ; ii) tampon B : acétonitrile de qualité CLHP contenant 0,1 % d’acide formique. Ouvrez l’application Thermo XCalibur Instrument Setup pour commencer à développer la méthode. Recherchez deux cases dans la barre latérale gauche de cette fenêtre – la première boîte permet le développement de la méthode de chromatographie, et la deuxième boîte permet le développement de la méthode de spectrométrie de masse. Développement de méthodes de chromatographie liquide :Régler un débit de 0,25 mL/min et commencer la méthode à 20 % B, en augmentant à 95 % B sur une période de 12 minutes. Au cours de la minute suivante, abaissez le tampon B à 20 % B et maintenez ce niveau pendant les 2 minutes suivantes.NOTE: Les 2 dernières minutes d’écoulement à 20% B sont critiques pour que la pression de la colonne redescende à la pression initiale et équilibre la colonne avec les rapports tampons appropriés. Si cette étape d’équilibrage n’est pas incluse, les temps de rétention seront décalés pour tous les échantillons exécutés ultérieurement. Créez un fichier de mélodie avec les paramètres suivants :Ouvrez l’application Tune et créez un nouveau fichier tune. Appliquez également tous les paramètres chevauchés du module Configuration de la méthode (voir étape 5.3.9.3) à ce fichier de réglage, notamment la plage de numérisation, la résolution, la polarité, la cible AGC et l’IT maximal. Réglez le gaz Sheath sur 30, le gaz auxiliaire sur 3 et le gaz Sweep sur 3 également. Réglez la tension de pulvérisation sur 3 kV, la température capillaire sur 300 et le niveau RF de la lentille S sur 60. Développement de méthodes de spectrométrie de masse :Dans la liste en bas à gauche des analyses potentielles, faites glisser et déposez Full MS au centre de la fenêtre. Assurez-vous de cliquer sur le carré Full MS après la chute pour ajuster les paramètres. La durée totale de la méthode MS est de 13 min.NOTE: La méthode LC est plus longue que la méthode MS parce que les 2 dernières minutes sont consacrées au reconditionnement de la colonne et non à la quantification des métabolites. Sur le côté droit du module, sous Propriétés de la méthode, assurez-vous que la durée et la durée d’exécution de la méthode sont définies sur 13h00 min. Exécutez cette analyse complète en mode positif à une résolution de 70 000 et une cible AGC de 1 × 106. Définissez l’IT maximum sur 100 ms et la plage de balayage de 300 m/z à 700 m/z. Sous Tune Files vers le haut du module, observez que le fichier de réglage qui vient d’être créé est lié à cette méthode. Exécutez la méthode de détection MitoSox Red avec des injections d’échantillons de 2 μL.