Özet

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

Published: April 21, 2023
doi:

Özet

Este protocolo detalha o procedimento para obter imagens de respostas de cálcio no colículo superior (CS) de camundongos acordados, incluindo a obtenção de imagens da atividade de um único neurônio com microscopia de dois fótons, deixando o córtex intacto em camundongos selvagens, e a obtenção de imagens de todo o SC com microscopia de campo largo em camundongos mutantes do córtex parcial.

Abstract

O colículo superior (CS), uma estrutura mesencefálica conservada evolutivamente em todos os vertebrados, é o centro visual mais sofisticado antes do surgimento do córtex cerebral. Ele recebe entradas diretas de ~30 tipos de células ganglionares da retina (RGCs), com cada uma codificando uma característica visual específica. Permanece indefinido se o CT simplesmente herda características retinianas ou se ocorre processamento adicional e potencialmente de novo no CS. Para revelar a codificação neural da informação visual no CS, fornecemos aqui um protocolo detalhado para registrar opticamente as respostas visuais com dois métodos complementares em camundongos acordados. Um método usa microscopia de dois fótons para obter imagens da atividade do cálcio em resolução de célula única sem ablar o córtex sobreposto, enquanto o outro usa microscopia de campo largo para obter imagens de toda a CT de um camundongo mutante cujo córtex é em grande parte subdesenvolvido. Este protocolo detalha esses dois métodos, incluindo preparação animal, injeção viral, implante de placa cefálica, implante de plug, aquisição de dados e análise de dados. Os resultados representativos mostram que a imagem de cálcio de dois fótons revela respostas neuronais visualmente evocadas em resolução de célula única, e a imagem de cálcio de campo largo revela atividade neural em toda a CT. Combinando esses dois métodos, pode-se revelar a codificação neural no CT em diferentes escalas, e tal combinação também pode ser aplicada a outras regiões cerebrais.

Introduction

O colículo superior (CS) é um importante centro visual em todos os vertebrados. Em mamíferos, recebe entradas diretas da retina e do córtex visual1. Embora o registro óptico tenha sido amplamente aplicado no córtex 2,3,4,5, sua aplicação no CT é dificultada por acessos ópticos precários 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19. O objetivo deste protocolo é fornecer detalhes sobre dois métodos complementares para o registro óptico da atividade neural no CT.

A CT está localizada abaixo do córtex e do seio transverso, o que limita o acesso óptico aos neurônios coliculares. Uma abordagem para superar essa limitação é aspirar a cortical sobreposta e expor o SC ântero-lateral7,9,10,13,14,19. No entanto, como o CT recebe entradas corticais, tal operação pode afetar a forma como os neurônios do CT respondem aos estímulos visuais. Para superar essa limitação, detalhamos aqui um protocolo alternativo para obter imagens da camada superficial do SC póstero-medial com um tampão de silicone, deixando o córtexintacto8,11. Especificamente, para alcançar a resolução de célula única, aplicamos microscopia de dois fótons para obter imagens de respostas de cálcio na CT póstero-medial de camundongos selvagens. Além disso, para obter ampla cobertura, aplicamos microscopia de campo largo para obter imagens de toda a CT de um camundongo mutante cujo córtex posterior não se desenvolveu20.

Os dois métodos descritos neste protocolo são complementares entre si. A imagem de cálcio de dois fótons sem ablação do córtex é apropriada para registrar a atividade neural em resolução de célula única com entradas corticais intactas. A imagem de cálcio de campo largo é apropriada para registrar a atividade neural em toda a CT enquanto sacrifica a resolução espacial.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes de bem-estar animal e aprovados pela IACUC no Instituto Chinês de Pesquisa do Cérebro, Pequim. OBS: O cronograma para este protocolo é o seguinte: 1) fazer a ventosa; 2) injetar o vírus; 3) implantar a placa cefálica; 4) após 3 semanas, implantar o plug; 5) após uma recuperação de ~3 dias e habituação na esteira, realizar imagens de dois fótons/campo largo. 1. Preparo…

Representative Results

As Figuras 1A,B mostram como fazer a ventosa e os plugs, respectivamente. A Figura 2 mostra como implantar o plugue com sucesso. Após o implante do plug, o SC póstero-medial é exposto, como mostra a Figura 2D. A Figura 3 mostra as respostas de cálcio dos neurônios SC de um exemplo de camundongo selvagem fotografado usando microscopia de dois fótons. O prisma triangular, que é fac…

Discussion

Etapas críticas do protocolo
A etapa mais crítica é a craniotomia nas etapas 5.2 e 5.3. Primeiro, o osso 0,5 mm posterior ao lambda é espesso e tem vasos sanguíneos dentro, o que pode causar sangramento durante o processo de perfuração. Espuma de gel adequada deve ser preparada para parar o sangramento. Em segundo lugar, há uma boa chance de angiorrhexis ao remover o osso logo acima do seio transverso. Para solução de problemas, uma abordagem alternativa é afinar o osso dentro do oval e rem…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32271060). Y.-t.L. desenhou a pesquisa, realizou o experimento, analisou os dados e escreveu o manuscrito. Z.L. e R.W. realizaram o experimento.

Materials

16x objective Nikon
50-mm lens Computar M5018-MP2
5-mm coverslip Warner instruments CS-5R
bandpass filter Chroma Technology HQ575/250 m-2p
butyl cyanoacrylate Vetbond, World Precision Instruments
camera for monitoring pupil FLIR BFS-U3-04S2M-CS
camera for widefield imaging Basler acA2000-165µm
corona treater Electro-Technic Products BD-20AC
dichroic Chroma Technology T600/200dcrb 
galvanometers Cambridge Technology
glass bead sterilizer RWD RS1502
microdrill RWD 78001
micromanipulator Sutter Instruments QUAD
photomultiplier tube Hamamatsu R3896
rotory encoder USdigital MA3-A10-125-N
self-curing dental adhesive resin cement  SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan
thermostatic heating pad  RWD 69020
Ti:Sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai HP DeepSee
translucent silicone adhesive  Kwik-Sil, World Precision Instruments
treadmill Xinglin Biology
Virus Strains
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Animals
C57BL/6J wild type Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Emx1-Cre The Jackson Laboratory  5628
Pals1flox/wt Christopher A. Walsh Lab
Software
ImageJ NIH Image
Labview National Instruments
MATLAB Mathworks

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