Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징
Özet
이 프로토콜은 야생형 마우스에서 피질을 그대로 유지하면서 이광자 현미경으로 단일 뉴런 활동을 이미징하고 부분 피질 돌연변이 마우스에서 광시야 현미경으로 전체 SC를 이미징하는 것을 포함하여 깨어 있는 마우스의 상구(SC)에서 칼슘 반응을 이미징하는 절차를 자세히 설명합니다.
Abstract
모든 척추동물에서 진화적으로 보존된 중뇌 구조인 상구(superior colliculus, SC)는 대뇌피질이 출현하기 전에 가장 정교한 시각 중추입니다. ~30가지 유형의 망막 신경절 세포(RGC)로부터 직접 입력을 받으며, 각 세포는 특정 시각적 특징을 인코딩합니다. SC가 단순히 망막 특징을 물려받는지, 아니면 SC에서 추가적이고 잠재적으로 새로운 처리가 발생하는지는 여전히 파악하기 어렵습니다. SC에서 시각 정보의 신경 코딩을 밝히기 위해 깨어 있는 쥐에서 두 가지 보완적인 방법으로 시각적 반응을 광학적으로 기록하는 자세한 프로토콜을 제공합니다. 한 가지 방법은 이광자 현미경을 사용하여 중첩 피질을 절제하지 않고 단일 세포 해상도로 칼슘 활성을 이미지화하는 반면, 다른 방법은 광시야 현미경을 사용하여 피질이 거의 발달하지 않은 돌연변이 쥐의 전체 SC를 이미지화합니다. 이 프로토콜은 동물 준비, 바이러스 주입, 헤드플레이트 이식, 플러그 주입, 데이터 수집 및 데이터 분석을 포함한 이 두 가지 방법을 자세히 설명합니다. 대표적인 결과는 이광자 칼슘 이미징이 단일 세포 해상도에서 시각적으로 유발된 신경 반응을 나타내고 광시야 칼슘 이미징이 SC 전체에 걸쳐 신경 활동을 나타낸다는 것을 보여줍니다. 이 두 가지 방법을 결합하면 SC의 신경 코딩을 서로 다른 규모로 밝힐 수 있으며 이러한 조합은 다른 뇌 영역에도 적용될 수 있습니다.
Introduction
상구(superior colliculus, SC)는 모든 척추동물에서 중요한 시각 중추입니다. 포유류에서는 망막과 시각 피질(visual cortex)1로부터 직접 입력을받는다. 광학 기록은 피질 2,3,4,5에 널리 적용되어 왔지만, SC에서의 적용은 열악한 광학 액세스 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17에 의해 방해를 받는다 ,18,19. 이 프로토콜의 목표는 SC에서 신경 활동을 광학적으로 기록하기 위한 두 가지 보완 방법에 대한 세부 정보를 제공하는 것입니다.
SC는 피질과 횡동(transverse sinus) 아래에 위치하여 측부 뉴런에 대한 광학적 접근을 제한합니다. 이러한 한계를 극복하기 위한 한 가지 접근법은 중첩 피질을 흡인하고 전방 SC 7,9,10,13,14,19를 노출시키는 것입니다. 그러나 SC는 대뇌 피질 입력을 받기 때문에 이러한 작업은 SC 뉴런이 시각적 자극에 반응하는 방식에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 한계를 극복하기 위하여는, 우리는 피질을 온전하게 남겨두면서 실리콘 마개를 가진 후방-내측 SC의 표층을, 8,11 남겨 두는 양자택일 의정서를 여기에서 상세히 기술한다. 특히, 단일 세포 분해능을 달성하기 위해 야생형 마우스의 후방-내측 SC에서 칼슘 반응을 이미지화하기 위해 이광자 현미경을 적용했습니다. 또한 넓은 범위를 달성하기 위해 광시야 현미경을 적용하여 후방 피질이 발달하지 않은 돌연변이 쥐의 전체 SC를 이미지화했습니다20.
이 프로토콜에 설명된 두 가지 방법은 서로 보완적입니다. 피질을 절제하지 않는 2광자 칼슘 이미징은 손상되지 않은 피질 입력으로 단일 세포 해상도로 신경 활동을 기록하는 데 적합합니다. 광시야 칼슘 이미징은 공간 해상도를 희생하면서 전체 SC의 신경 활동을 기록하는 데 적합합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜의 중요한 단계
가장 중요한 단계는 5.2단계와 5.3단계의 개두술입니다. 첫째, 람다 뒤쪽 0.5mm의 뼈는 두껍고 내부에 혈관이 있어 시추 과정에서 출혈이 발생할 수 있습니다. 출혈을 멈추기 위해 적절한 젤 폼을 준비해야 합니다. 둘째, 횡동(transverse sinus) 바로 위의 뼈를 제거할 때 혈관 손상증이 발생할 가능성이 높습니다. 문제 해결을 위한 한 가지 다른 방법은 타원형 내부?…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (32271060)의 지원을 받고 있습니다. Y.-t.L.은 연구를 설계하고, 실험을 수행하고, 데이터를 분석하고, 원고를 썼습니다. Z.L.과 R.W.가 실험을 수행하였다.
Materials
| 16x objective | Nikon | ||
| 50-mm lens | Computar | M5018-MP2 | |
| 5-mm coverslip | Warner instruments | CS-5R | |
| bandpass filter | Chroma Technology | HQ575/250 m-2p | |
| butyl cyanoacrylate | Vetbond, World Precision Instruments | ||
| camera for monitoring pupil | FLIR | BFS-U3-04S2M-CS | |
| camera for widefield imaging | Basler | acA2000-165µm | |
| corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | |
| dichroic | Chroma Technology | T600/200dcrb | |
| galvanometers | Cambridge Technology | ||
| glass bead sterilizer | RWD | RS1502 | |
| microdrill | RWD | 78001 | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | QUAD | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu | R3896 | |
| rotory encoder | USdigital | MA3-A10-125-N | |
| self-curing dental adhesive resin cement | SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan | ||
| thermostatic heating pad | RWD | 69020 | |
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP DeepSee | |
| translucent silicone adhesive | Kwik-Sil, World Precision Instruments | ||
| treadmill | Xinglin Biology | ||
| Virus Strains | |||
| rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m | Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing | ||
| Animals | |||
| C57BL/6J wild type | Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing | ||
| Emx1-Cre | The Jackson Laboratory | 5628 | |
| Pals1flox/wt | Christopher A. Walsh Lab | ||
| Software | |||
| ImageJ | NIH Image | ||
| Labview | National Instruments | ||
| MATLAB | Mathworks |
Referanslar
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