여기서는 세포 초미세 구조와 관련된 희귀 단백질의 국소화를 조사하기 위한 도구로서 내인성 형광 표지를 기반으로 하는 최적화된 절편 상관 광전자 현미경을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법의 힘은 바필로마이신 처리 없이 굶주린 세포에서 내인성 LC3의 초구조적 국소화에 의해 입증되었습니다.
전자 현미경(EM)을 통해 초미세 구조 수준에서 자가포식 소기관의 시각화는 자가포식 과정을 이해하는 데 중요한 세부 사항을 밝히고 정체성을 확립하는 데 필수적입니다. 그러나 EM 분석법은 분자 정보가 부족한 경우가 많아 EM으로 얻은 초미구조 정보와 특정 자가포식 단백질의 형광 현미경 기반 국소화 간의 상관관계를 방해합니다. 또한, 변경되지 않은 세포 조건에서 자가포식체의 희귀성은 고배율이 필요한 EM에 의한 조사를 방해하므로 제한된 시야를 제공합니다.
이 두 가지 문제에 대한 해답으로, 형광 표지를 기반으로 하는 절편 상관 광전자 현미경(CLEM) 방법을 적용하여 일반적인 자가포식 마커인 LC3를 EM 초미세 구조와 연관시켰습니다. 이 방법은 다른 관련 마커와 함께 LC3 라벨링을 위해 형광 현미경 검사에서 세포를 신속하게 스크리닝하는 데 사용되었습니다. 그 후, 선택된 LC3 표지 스폿의 근본적인 초구조적 특징을 CLEM에 의해 식별했습니다. 이 방법은 리소좀 산성화 억제제를 첨가하지 않고 굶주린 세포에 적용되었습니다.
이러한 조건에서 LC3는 주로 자가포식체에서 발견되었으며 LC3가 급격히 분해되는 자가리소좀에서는 드물게 발견되었습니다. 이러한 데이터는 이 접근법의 타당성과 민감도를 모두 보여주며, CLEM이 약물 치료나 유전적 변형 없이 자연 조건에서 LC3 매개 자가포식에 대한 초구조적 통찰력을 제공하는 데 사용될 수 있음을 보여줍니다. 전반적으로, 이 방법은 광학 현미경을 EM 데이터에 연결하여 자가포식 단백질 및 기타 희소 항원의 초구조적 국소화 연구에 유용한 도구를 제공합니다.
자가포식은 세포질 단백질과 세포소기관의 청소와 재활용을 위한 핵심 과정입니다. 거대 자가포식(이하 자가포식)의 과정은 세포가 리소좀 분해를 위해 세포질 분자와 세포소기관을 둘러쌀 수 있도록 하는 이중막 소기관인 자가포식소체의 형성을 포함합니다. 자가포식은 대부분의 세포에서 기초 수준에서 발생하며 기아 또는 세포 스트레스와 같은 세포 상태에 반응하여 상향 조절됩니다. 자가포식은 분해를 위해 특정 구조나 단백질을 표적으로 하는 기질 특이적 방식으로 발생하거나 세포질의 일부를 포함하는 비선택적 벌크 과정으로 발생합니다. 선택적 자가포식에서 자가포식체는 Atg8 계열 단백질(미세소관 관련 단백질 1A/B 경쇄 3A/B/C [LC3] 및 GABARAP)을 재활용 엔도솜, 골지체 및/또는 소포체(ER)1에서 유래한 막에 접합하여 형성됩니다. LC3는 세포질의 자가포식 화물을 직접 인식하거나 P62/SQSTM과 같은 선택적 자가포식 어댑터를 통해 인식합니다. 그런 다음 새로운 자가포식막을 LC3에 접합하고, 확장 및 융합하여 자가포식체라고 하는 화물을 둘러싸는 완성된 이중막을 형성할 수 있습니다. 자가포식체는 성숙하고 결국 엔도솜 또는 리소좀과 융합하며, 그 후 자가포식 화물과 어댑터가 분해된다2.
자가포식 형성, 성숙 및 융합에 대한 연구는 종종 광학 현미경 기술을 사용합니다. LC3의 형광 현미경은 일반적으로 다양한 조건에서 자가포식체의 수와 세포 국소화를 평가하는 데 사용됩니다. 또한, LC3를 소위 탠덤 프로브에서 pH 민감성 GFP 및 pH 안정 RFP에 결합함으로써 GFP 형광 손실3의 함수로 살아있는 세포에서 자가포식의 전체 플럭스를 측정할 수 있습니다. 이러한 접근법은 연구자들이 다양한 조건에서 자가포식의 역할과 메커니즘을 이해하는 데 유용한 도구입니다. 또 다른 귀중한 도구는 전자 현미경(EM)으로, 자가포식 4,5,6,7,8의 여러 단계에서 자가포식 소기관의 미세 구조를 보여줍니다. 현재까지 EM은 형태학에 따라 다양한 자가포식 막을 구별하여 자가포식 형성의 정확한 단계를 식별하기 위해 선택되는 방법입니다: phagophore(완전히 닫히지 않은 이중막), autophagosome(세포질 화물 주위의 닫힌 이중막) 및 autolysosome(내부 자가포식 막의 [부분] 손실). 그러나 분자 정보가 없는 형태학은 오인이나 모호성이 발생하기 쉽습니다. Immuno-EM은 자가포식 세포소기관의 동시 분자 특성 분석 및 형태학적 분류를 위한 가장 포괄적인 방법입니다. 예를 들어, 해동된 극저온 절편에서 LC3의 immunogold 표지를 통해 LC3의 초구조적 국소화와 LC3 표시 소기관을 정밀하게 식별할 수 있습니다9.
EM의 단점은 자가포식막의 미세한 미세구조를 관찰하고 immuno-EM의 경우 관심 단백질을 표시하는 라벨을 찾는 데 필요한 고배율과 함께 제공되는 작은 시야입니다. 단백질이 부족하고 단백질 수준이 낮기 때문에 일반적으로 자가포식체의 정량적 EM 분석이 방해가 됩니다. 자가포식체의 수를 늘리기 위해 세포를 굶주리고 리소좀 산성화 및 분해 억제제인 바필로마이신 A1(BafA1)으로 처리합니다. BafA1 치료가 없으면 이러한 세포 소기관이 부족하기 때문에 EM에 의한 자가포식체 검색은 시간이 많이 걸립니다. 이 원고에 제시된 방법은 EM을 추가로 준비하기 전에 형광 현미경에서 해동된 극저온 절편에 대한 내인성 LC3의 형광 표지 및 이미징을 통해 이 문제를 해결합니다. 그런 다음 형광 이미지는 EM에서 LC3 표지 구조를 찾는 데 도움이 됩니다. 수집 후 EM 이미지는 형광 이미지와 상관 관계가 있어 세포의 초미세 구조에 분자 정보(LC3의 존재)를 추가합니다. 이 ‘절편 내 CLEM’ 분석법은 특히 처리되지 않은 조건에서 EM에 의한 후속 식별 및 분류를 위해 LC3 표지 구조를 찾는 능력을 크게 향상시킵니다.
이 방법은 굶주린 간모세포종 유래 HEPG210 세포에 적용되어 변경되지 않은(즉, BafA1이 사용되지 않은) 조건에서 자가포식체를 찾았습니다. 상대적으로 적은 수의 형광 반점(90nm 절편에서 세포 프로파일당 1개 미만)이 발견되었으며, 이는 LC311의 높은 회전율과 일치합니다. LC3-puncta의 이러한 희소성은 CLEM의 가치를 강조했습니다. EM에서 이미징을 위해 여러 형광 반점이 있는 영역을 선택함으로써 LC3 양성 소기관을 발견하고 기존 immuno-EM보다 훨씬 더 효과적인 방식으로 특성화했습니다. 그 결과, LC3 양성 세포소기관의 대다수가 형태학에 의해 정의된 자가포식체(autophagosome)라는 사실이 밝혀졌는데, 이는 자가리소좀이 더 흔한 BafA1 처리 세포에서 얻은 결과와 대조된다9. 이러한 데이터는 절편 CLEM을 사용하면 자가포식 흐름을 억제할 필요 없이 초구조적 수준에서 자가포식을 연구할 수 있음을 보여줍니다.
여기에 제시된 방법은 극저온 절편 기반 절편 CLEM의 최근 발전, 즉 IF 라벨링의 고감도 및 FM과 EM 14,24 간의 정확한(<100nm 오류) 상관 관계를 활용합니다. 그 결과 형광 표지가 희소한 내인성 단백질에 대한 민감도와 이를 EM 초미세 구조에 높은 정밀도로 오버레이할 수 있는 능력을 갖춘 분석법이 탄생했습니다. 따라서, 이 방법은 외인성 표지 단백질의 (과잉)발현과 덜 민감한 EM 표지의 사용을 피할 수 있습니다. 이 방법의 타당성은 리소좀 억제제를 사용하지 않고 굶주린 세포에서 내인성 LC3에 대한 CLEM의 예에 의해 표시됩니다.
Tokuyasu 방법으로 얻은 해동 동결 절편은 수지 절편과 달리 항체에 대한 투과성이 있기 때문에 immuno-EM에 이상적인 샘플입니다. 온화한 고정 및 대조 절차와 결합하여, 이는 일반적으로 상세한 미세 구조를 손상시키지 않으면서 다른 방법에 비해 탁월한 표지 효율을 산출하고, 세포막을 훌륭하게 시각화한다 12,25,26. 또한 cryosection은 형광 현미경과 호환성이 높기 때문에 CLEM에 유용한 기질이 됩니다. 동결절편에 대한 고전적인 immunogold 표지와 CLEM은 모두 세포 내 조직을 이해하는 데 중요한 통찰력을 제공했습니다 14,27,28,29,30.
현재, 해동된 극저온 절편에 대한 CLEM의 적용은 접근법의 품질, 적용 가능성 및 정확성을 개선한 지속적인 개발및 최적화(14,20,24,31,32,33,34)의 결과로 더욱 보편화되고 있습니다. 이제, 대형 IF 및 EM 이미지 타일셋의 정확한 상관 관계를 통해, 이 기술은 형광 표지된 내인성 세포 성분 14,32,33의 미세구조에 대한 스크리닝을 용이하게 합니다. 이는 금 표지 구조를 검색하는 데 일반적으로 고배율이 필요하고 따라서 더 힘들고 시간이 많이 걸리는 기존 immuno-EM에 비해 장점이 있습니다. 이러한 이유로 LC3를 초미세 구조로 국소화하면 CLEM의 이점을 크게 누릴 수 있습니다. LC3 양성 소기관은 자가포식 청소가 차단될 때(즉, 세포가 BafA1 또는 pH 상승제로 처리될 때) 흔한 반면, 자가포식 소기관은 변경되지 않거나 결핍된 세포에서 빠르게 제거되어 정상 상태 수준이 매우 낮습니다. 이러한 조건에서 기존 immuno-EM을 사용하여 LC3 표지 소기관을 찾는 것은 어려울 수 있으며 CLEM은 분명한 이점을 제공합니다.
이전에는 LC3-GFP 또는 LC3-GFP-RFP 탠덤 프로브 35,36,37,38,39의 이소성 발현을 사용하는 연구에서 수지 절편상의 CLEM을 적용했습니다. 이러한 연구에서, 형광 이미징은 아크릴 수지 섹션(40)에 매립하기 전에 또는 직접 수행되었으며, 샘플은 이후에 EM에 의해 스크리닝되었습니다. 수지 임베딩에는 몇 가지 장점이 있습니다. 자가포식 미세구조는 일반적으로 잘 보존되어 있으며, 특히 물질이 고압-동결(40)인 경우에 더욱 그러하다. 더욱이, 중금속 염색 수지 포매 재료의 대비는 일반적으로 우라닐 염색 극저온 절편보다 더 뚜렷합니다. 수지 포매 절편은 어레이 단층 촬영, FIB-SEM 또는 연속 블록페이스 SEM과 같은 체적 EM 방법과 호환되지만 극저온 절편은 그렇지 않습니다. 임베딩 전에 이미징을 수행하는 접근법에서 살아있는 세포 이미징은 극저온 절편의 CLEM에서 사용할 수 없는 옵션41입니다. 이러한 대안에 비해 극저온 절편에서 CLEM의 주요 이점은 높은 IF 신호로, 막 투과화 또는 과발현 없이 희귀 단백질의 면역 국소화가 가능합니다. 이는 잠재적인 막 추출, 과발현 인공물42 및 피험자의 유전자 변형을 방지하며, 이는 IF와 EM의 넓은 영역을 상호 연관시킬 수 있는 가능성과 결합되어 LC3 및 자가포식을 연구하는 데 탁월한 도구가 됩니다.
여기에서 굶주린 HEPG2 세포에 절편 CLEM을 적용한 결과 LC3가 주로 자가포식체로 식별된 구조에 국한된 것으로 나타났습니다. 또한, 몇 개의 약한 형광 반점이 autolysosome에서 발견되었습니다. 이는 BafA19 로 처리된 세포와 정반대이며, 자가포식체가 리소좀과 융합되면 자가포식 단백질이 급격히 분해되는 것을 반영합니다. 전반적으로, 데이터는 해동된 극저온 절편의 CLEM이 네이티브 조건에서 LC3 매개 자가포식에 대한 통찰력을 제공할 수 있음을 보여주었습니다. 이 데이터는 또한 낮은 수준의 온전한 LC3 에피토프만 포함하는 오토리소좀에서도 LC3가 검출되었기 때문에 기술의 민감도를 강조합니다. 다양한 모델과 조건에서 LC3를 이미징하여 이 기술을 추가로 적용하면 LC3 관련 식균작용 또는 ATG8을 단일 막에 접합하는 것과 같은 자가포식 및 기타 LC3 매개 생물학적 과정에 대한 이해가 향상될 것입니다.
자가포식 외에도 절편 CLEM은 세포 분열, 감염, 조직의 희귀 세포 유형, 운동세포, 원발성 섬모 또는 세포 유형 특이적 소기관과 같은 다른 희귀 사건 또는 구조에 적용할 수 있습니다. IF에 의한 관심 주제에 대한 효과적인 스크리닝은 이러한 희귀성에 대한 초구조적 연구를 크게 촉진할 수 있습니다. 또한, 이 기술은 기존의 immuno-EM보다 더 민감한 방식으로 단백질을 국소화하는 데 사용될 수 있음이14 에 밝혀졌습니다. 고정 길이를 조정하면 이러한 감도를 더욱 확장하여 매우 풍부하지 않거나 항원이 부족한 단백질의 초구조적 국소화를 가능하게 할 수 있습니다. 마지막으로, 절편 CLEM 분석법은 정량적 수의 소기관을 신속하게 선택할 수 있도록 하여 주어진 단백질의 초구조적 분포에 대한 보다 강력한 분석을 용이하게 합니다.
극저온 절편에 대한 CLEM은 극저온 절편을 위한 장비와 전문 지식이 필요합니다. 이러한 도구(예: cryomicrotomes)에 액세스할 수 있는 그룹에서 절편 CLEM의 구현은 간단하며 대부분의 실험실에서 액세스할 수 있는 설정인 자동화된 광시야 현미경만 있으면 됩니다. 또한 이 방법은 전 세계 EM 시설에서 사용할 수 있습니다. 온-단면 CLEM은 확립된 IF 및 EM 방법의 응용을 결합하기 때문에, 이 방법은 쉽게 적응할 수 있으며, 예를 들어, 단 층 촬영(20,33,43), 제한된 수의 섹션(44)의 연속 단면 부피 EM, 또는 초고해상도 현미경(45)과 결합될 수 있다. 이 방법의 다양성은 광범위한 생물학적 질문에 대한 응용을 지원합니다.
The authors have nothing to disclose.
유익한 토론과 피드백을 주신 위트레흐트 대학 의료 센터 분자 의학 센터의 동료들에게 감사드립니다. 현미경 기술을 지속적으로 개선해 주신 Klumperman 연구실의 전현직 동료들에게 감사드립니다. 이 작업에 사용된 EM 인프라는 네덜란드 연구 위원회(NWO)가 자금을 지원하는 연구 프로그램인 NEMI(National Roadmap for Large-Scale Research Infrastructure)의 일부입니다(프로젝트 번호 184.034.014).
Chemicals and reagents | |||
Antibody donkey anti-mouse Alexa Fluor 488 | Life Technologies | #A21202 | use 1:250 |
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568 | Life Technologies | A#10042 | use 1:250 |
Antibody mouse anti-LC3 | Cosmo Bio | CTB-LC3-2-IC | use 1:100 |
Antibody rabbit anti-LAMP1 | Cell Signaling | 9091 | use 1:250 |
Bovine serum Albumin, fraction V | Sigma-Aldrich | A-9647 | |
BSA-c | Aurion | 900.099 | |
BSA-conjugated gold | Cell Microscopy Core, UMC Utrecht | BSAG 5 nm | |
Water-free Chloroform | Merck | 1.02447.0500 | |
DAPI | Invitrogen | 10184322 | Use at end concentration of 10 µg/ml |
EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
Fish-skin Gelatin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
Food-grade gelatin | Merck | G1890 | |
Formvar, Vinylec E | SPI | 02492-RA | |
Gluteraldehyde | Serva | 23115.01 | See CAUTION note |
Glycerol | Boom | MBAK 7044.1000 | |
Glycine | Merck | 1042010250 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Methylcellulose, 25 centipoises | Sigma-Aldrich | M-6385 | |
MgSO4 | Riedel-de Haen | 12142 | |
Na2HPO4 (PB component A) | Merck | 106580-0500 | |
NaBH4 | Merck | 806373 | |
NaH2PO4 (PB component B) | Merck | 106346 | |
NH4OH | Sigma-Aldrich | 221228-0025 | |
Oxalic acid | Merck | 100495 | |
Paraformaldehyde prills | Sigma-Aldrich | 441244 | See CAUTION note |
PIPES | Merck | 110220 | |
Protein-A conjugated gold | Cell Microscopy Core, UMC Utrecht | PAG 5, 10, 15 or 20 nm | |
Sucrose D(+) | VWR | 27483294 | |
Uranyl acetate | SPI | 020624-AB | See CAUTION note |
Tools and consumables | |||
Pick-up loop | Electron Microscopy Sciences | 70944 | |
Filter paper, qualitative, medium-fast | LLG | 6.242 668 | |
Finder grids | Ted Pella | G100F1 | |
Grids | Cell Microscopy Core, UMC Utrecht | CU 100 mesh | |
Microscopes | |||
Leica Thunder widefield microscope | Leica | Components: 100x, 1.47 NA TIRF objective; Photometrics prime 95B sCMOS camera; LAS X software; | |
Leica UC7 ultracryomicrotome | Leica | ||
Tecnai T12 | FEI | Components: Veleta VEL-FEI-TEC12-TEM camera; SerialEM software | |
Software | |||
ec-CLEM in icy | open source | Paul-Gilloteaux et al., 2017 | |
Fiji | open source | Schindelin et al., 2012 | |
IMOD | open source | Mastronarde et al., 2017 | |
Photoshop | Adobe | ||
SerialEM | open source | Mastronarde et al., 2018 |