Caenorhabditis elegans의 배아 생존력 및 무리 크기 측정

참고: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 1. 실험용 플레이트 준비 MYOB(Modified Youngren’s, Only Bacto-peptone) 배지로 직경 35mm의 페트리 접시를 준비합니다. MYOB 플레이트를 만들기 위해 Bacto 한천 20g, NaCl 2g, Trizma-HCl 0.55g, Trizma-OH 0.24g, Bacto 펩톤 3.1g, 콜레스테롤 1.6mL를 ddH2O 1L에 넣고121°C에서 40분 동안 오토클레이브합니다. 55°C로 식히고 멸균 기술을 사용하여 용융된 매체 4mL를 각 35mm 페트리 접시에 붓습니다.알림: MYOB 1리터는 ~250개의 플레이트를 만들며 4°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다. 각 균주에 대해 3개의 반복 세트가 있는 복제당 최소 10명의 개체를 권장합니다. 멸균 기술을 사용하여 플레이트 중간에 OP50 박테리아의 작은 반점(약 50μL)으로 플레이트를 시딩합니다.참고: 작은 잔디밭은 작은 지점이 수컷과 자웅동체 사이의 만남을 증가시켜 짝짓기 기회를 증가시키기 때문에 교차 수정을 평가하는 데 특히 중요합니다. 2. 배아 생존력 분석(자웅동체 자가수정) 1일차각 접시의 뒷면에 라벨을 붙입니다. 실험 내내 각 플레이트와 각각의 웜을 추적해야 합니다.참고: 선호하는 라벨링 기술-1일차: 웜 1, 1일차: 웜 2, … 등. 개별 L4 단계 자웅동체를 각 플레이트에 옮깁니다. 배아나 다른 벌레가 접시에 옮겨지지 않도록 하십시오. 벌레가 성충으로 발달하고 20°C의 표준 배양 온도에서 24시간 동안 자손을 낳도록 합니다. 3일차에 이 플레이트에 점수를 매기십시오.참고: 온도에 민감한 돌연변이의 경우 실험 온도가 변경될 수 있습니다. 온도에 민감한 돌연변이의 경우, 배아 생존력 분석은 허용 온도(15-16 °C) 및 비허용 온도(24-26 °C) 모두에서 수행되어야 합니다. 2일차새 플레이트 세트에 라벨을 붙입니다-2일차: 웜 1, 2일차: 웜 2, … 등. 1일차 개별 웜을 새 플레이트로 옮깁니다.참고: 이 벌레는 성체에 도달해야 하며 야생형 벌레는 이미 배아를 낳기 시작했어야 합니다. 벌레가 20°C 또는 기타 적절한 온도에서 24시간 동안 배아를 낳도록 합니다. 4일째에 이 판에 점수를 매기십시오. 3일차새 접시 세트에 라벨을 붙인다. 3일차: 웜 1, 3일차: 웜 2, … 등. 2일차 개별 웜을 새 플레이트로 옮깁니다. 20°C 또는 기타 적절한 온도에서 24시간 동안 자손을 낳도록 합니다. 5일째에 이 번호판에 점수를 매기십시오.알림: 온도가 낮을 경우 부화 시간이 늘어납니다. 그에 따라 조정하십시오. 미세 마커를 사용하여 35mm 뚜껑에 격자 패턴을 그립니다. 이전에 계수된 웜을 추적하기 위해 계수를 위해 테스트 플레이트 아래에 격자 뚜껑을 놓습니다(그림 1A-B).감별 세포 계수기를 사용하여 자손의 존재 또는 부재에 대해 1일째 플레이트에 점수를 매깁니다. 살아있는 애벌레와 부화하지 않은 배아를 세십시오.참고: 이 시점에서 생존 가능한 배아가 부화해야 할 만큼 충분한 시간이 경과했습니다. 부화하지 않은 배아는 죽은 것으로 추정됩니다. 개별 정사각형 내에서 정사각형 안에 있는 부화하지 않은 배아와 살아있는 유충을 세십시오(그림 1C-F). 정사각형 테두리에 있는 웜의 경우 웜 헤드의 위치를 기준으로 계산합니다. 머리가 사각형의 위쪽과 왼쪽 가장자리에 닿는 웜을 세십시오(아래쪽 또는 오른쪽 가장자리에 닿는 웜은 계산하지 마십시오. 그림 1D). 이 분석을 위해 수정되지 않은 난모세포를 계산하지 마십시오(그림 1F). 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아의 수를 실험실 노트에 기록하십시오. 4일차2.3.3.1 단계에 설명된 대로 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아를 세어 2일차 플레이트를 채점합니다. 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아의 수를 실험실 노트에 기록하십시오. 5일차2.3.3.1 단계에 설명된 대로 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아를 세어 3일째 플레이트를 채점합니다. 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아의 수를 실험실 노트에 기록하십시오. 데이터 분석에 설명된 방법을 사용하여 얻은 데이터를 분석합니다.참고: 일부 유전적 돌연변이는 생식 주기가 지연되거나 확장될 수 있습니다. 3일차 플레이트 이후에도 배아가 계속 산란되는지 개별 균주를 모니터링합니다. 배아 생산이 4 일까지 중단되지 않으면 성인을 새로운 판으로 계속 옮깁니다. 3. 배아 생존력 분석(수컷/자웅동체 교차 수정) 1일차각 접시의 뒷면에 라벨을 붙입니다. 실험 내내 각 플레이트와 각각의 웜을 추적해야 합니다. 개별 L4 자웅동체 벌레를 각 플레이트에 옮깁니다. 배아나 다른 벌레가 접시에 옮겨지지 않도록 하십시오.참고: 정자를 생산하지 않는 fog-2 기능 상실 돌연변이와 같은 여성화 균주를 자웅동체 대신 사용할 수 있습니다. 단일 L4 수컷 벌레를 L4 자웅동체가 들어 있는 각 라벨이 붙은 판에 옮깁니다. 배아나 다른 벌레가 접시에 옮겨지지 않도록 하십시오.참고: plg-1 변종 수컷과 같은 균주는 짝짓기 후 자웅동체 외음부에 교합 플러그를 부착하기 때문에 짝짓기가 발생했는지 여부를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 벌레가 20°C 또는 다른 적절한 온도에서 24시간 동안 짝짓기를 하고 자손을 낳도록 합니다. 3일째에 살아있는 유충 대 부화하지 않은 배아에 대해 이 플레이트에 점수를 매깁니다. 2일차새 플레이트 세트에 라벨을 붙이고 위의 2일차와 같이 웜을 옮깁니다. 이 경우 자웅동체와 수컷을 모두 새 판에 옮겨야 합니다. 자웅동체가 성인기에 도달했는지 확인하십시오. 자웅동체가 20°C 또는 다른 적절한 온도에서 24시간 동안 자손을 낳도록 합니다. 4일째에 살아있는 유충 대 부화하지 않은 배아에 대해 이 플레이트에 점수를 매깁니다. 3일차새 플레이트 세트에 라벨을 붙이고 위의 3일차와 같이 웜을 옮깁니다. 자웅동체와 수컷을 모두 새 접시에 옮겨야 합니다. 20°C 또는 다른 적절한 온도에서 24시간 동안 자손을 낳도록 합니다. 5일째에 살아있는 배아와 부화하지 않은 배아에 대해 이 플레이트에 점수를 매기십시오. 감별 세포 계수기를 사용하여 단계 2.3.3.1에 설명된 대로 1일째 플레이트에서 살아있는 유충과 부화되지 않은 배아를 계산합니다.알림: 접시는 4일차에 필요하므로 버리지 마십시오. 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아의 수를 실험실 노트에 기록하십시오. 4일차2.3.3.1 단계에서 설명한대로 2 일째 판에서 살아있는 자손과 부화하지 않은 배아를 계산합니다. 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아의 수를 실험실 노트에 기록하십시오. 남성용 1일차 플레이트를 확인하세요. 짝짓기가 발생하면 수컷에 대한 자웅동체의 예상 유전 비율은 50:50이어야 합니다. 1일차 플레이트에 수컷이 포함되어 있지 않으면 수컷과 자웅동체 사이의 짝짓기가 발생하지 않았습니다. 이 짝짓기 쌍을 버리고 이 관찰을 실험실 노트에 기록하십시오. 5일차2.3.3.1 단계에서 설명한대로 3 일째 판에서 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아를 계산합니다. 살아있는 유충과 부화하지 않은 배아의 수를 실험실 노트에 기록하십시오. 데이터 분석에 설명된 방법을 사용하여 얻은 데이터를 분석합니다. 4. 데이터 분석 식 (1)을 사용하여 균주의 주어진 생물학적 복제물의 배아 생존율 백분율을 계산합니다.참고: 살아있는 자손과 부화하지 않은 배아의 수는 실험 기간 동안의 일일 수를 합산하여 얻습니다.(1개) 부모 자웅동체에 의해 생산된 자손(부화하지 않은 배아 및 유충)의 수를 합산하여 주어진 균주의 벌레당 무리 크기를 계산합니다. 방정식 (2)를 사용하여 평균 새끼 크기를 계산합니다.(2개) 배아 생존율과 평균 무리 크기를 생물학적 복제 간의 평균 및 표준 편차와 함께 보고합니다. 대조군 데이터와 실험 데이터를 비교하는 스튜던트 t-검정을 수행합니다.