Adipozyten-spezifischer ATAC-Seq mit Fettgewebe mittels fluoreszenzaktivierter Zellkernsortierung

Das Fettgewebe, das darauf spezialisiert ist, überschüssige Energie in Form von Lipidmolekülen zu speichern, ist ein Schlüsselorgan für die Stoffwechselregulation. Die strikte Kontrolle der Adipozytenbildung und -erhaltung ist für die Funktion des Fettgewebes und die Energiehomöostase des gesamten Körpers von entscheidender Bedeutung¹. Viele transkriptionelle Regulatoren spielen eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle der Differenzierung, Plastizität und Funktion von Adipozyten. Einige dieser Regulatoren sind an Stoffwechselstörungen beim Menschen beteiligt ^2,3. Jüngste Fortschritte bei Hochdurchsatz-Sequenzierungstechniken für die Genexpression und epigenomische Analyse haben die Entdeckung der molekularen Regulatoren der Adipozytenbiologie weiter erleichtert⁴. Molekulare Profiling-Studien mit Fettgewebe sind aufgrund der Heterogenität dieser Gewebe schwierig durchzuführen. Fettgewebe besteht hauptsächlich aus Adipozyten, die für die Fettspeicherung verantwortlich sind, enthält aber auch verschiedene andere Zelltypen wie Fibroblasten, Endothelzellen und Immunzellen⁵. Darüber hinaus wird die zelluläre Zusammensetzung des Fettgewebes als Reaktion auf pathophysiologische Veränderungen wie Temperatur und Ernährungszustand dramatisch verändert⁶. Um diese Probleme zu lösen, haben wir zuvor eine transgene Reportermaus mit dem Namen Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) entwickelt, die GFP-markierte Ribosomen und mCherry-markierte biotinylierte Zellkerne in einer Cre-Rekombinase-abhängigen Weise produziert⁷. Das Dual-Labeling-System ermöglicht die zelltypspezifische Transkriptom- und Epigenomanalyse mit Geweben. Unter Verwendung von NuTRAP-Mäusen, die mit adipozytenspezifischen Adiponectin-Cre-Linien (Adipoq-NuTRAP) gekreuzt wurden, haben wir zuvor Genexpressionsprofile und Chromatinzustände aus reinen Adipozytenpopulationen in vivo charakterisiert und bestimmt, wie sie während der Adipositas verändert werden ^7,8. Zuvor konnten wir mit NuTRAP-Mäusen, die mit braunen und beigen Adipozyten-spezifischen Ucp1-Cre-Linien (Ucp1-NuTRAP) gekreuzt wurden, den epigenomischen Umbau der seltenen thermogenen Adipozytenpopulation, der beigen Adipozyten, als Reaktion auf Temperaturänderungen charakterisieren⁹.

ATAC-seq ist eine weit verbreitete analytische Methode zur Beurteilung der genomweiten Zugänglichkeit von Chromatinen. Die hyperreaktive Tn5-Transposase, die in ATAC-seq verwendet wird, ermöglicht die Identifizierung offener Chromatinregionen durch Markierung von Sequenzierungsadaptern im Chromatin-zugänglichen Bereich von Zellkernen¹⁰. ATAC-seq ist eine einfache Methode, liefert jedoch robuste Ergebnisse und ist auch bei Proben mit geringem Input hocheffizient. Es hat sich damit zu einer der beliebtesten epigenomischen Profiling-Methoden entwickelt und zum Verständnis der regulatorischen Mechanismen der Genexpression in verschiedenen biologischen Kontexten beigetragen. Seit der Erstellung des ursprünglichen ATAC-seq-Protokolls wurden verschiedene von ATAC-seq abgeleitete Techniken weiterentwickelt, um das Protokoll für verschiedene Arten von Proben zu modifizieren und zu optimieren. Zum Beispiel ist Fast-ATAC für die Analyse von Blutzellproben¹¹ konzipiert, Omni-ATAC ist ein optimiertes Protokoll für gefrorene Gewebeproben¹² und MiniATAC-seq ist wirksam für die Analyse von Embryonen im Frühstadium¹³. Die Anwendung der ATAC-seq-Methode auf Adipozyten, insbesondere aus Gewebeproben, ist jedoch immer noch eine Herausforderung. Neben der Heterogenität des Fettgewebes kann sein hoher Lipidgehalt effiziente Rekombinationsreaktionen durch die Tn5-Transposase auch nach der Zellkernisolierung beeinträchtigen. Darüber hinaus führt der hohe mitochondriale Gehalt in Adipozyten, insbesondere in braunen und beigen Adipozyten, zu einer hohen mitochondrialen DNA-Kontamination und zu verschwendeten Sequenzierwerten. In dieser Arbeit wird ein Protokoll für Adipozyten-spezifisches ATAC-seq unter Verwendung von Adipoq-NuTRAP-Mäusen beschrieben (Abbildung 1). Durch die Nutzung der fluoreszenzmarkierten Kernsortierung ermöglicht dieses Protokoll die Sammlung reiner Populationen von Adipozytenkernen fern von anderen störenden Zelltypen und die effiziente Entfernung von Lipiden, Mitochondrien und Gewebetrümmern. Daher kann dieses Protokoll zelltypspezifische, qualitativ hochwertige Daten generieren und die Verschwendung von mitochondrialen Reads minimieren, während im Vergleich zum Standardprotokoll eine geringere Menge an Input und Reagenzien verwendet wird.