Minipiglerde Subdural Yumuşak Elektrokortikografi (ECoG) Dizisi İmplantasyonu ve Uzun Süreli Kortikal Kayıt

Cerrahi ve davranışsal prosedürler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı yönergelerine uygun olarak yerel etik komite tarafından onaylandı ve GE11120A numaralı yetki ile yerel (Cenevre Kantonu) ve federal (İsviçre) veterinerlik yetkilileri tarafından onaylandı. Bu çalışmada 2-6 aylıkken (5-8 kg) dişi Göttingen minipigleri (n=7) kullanıldı. 1. Ameliyat öncesi planlama Yumuşak implant sisteminin in vitro karakterizasyonuKronoamperometri: Bir darbe üretecine paralel bağlanmış bir osiloskop kullanarak iki fazlı bir akım darbe evriminin (yani, voltaj geçici [VT]) enjeksiyonu üzerine voltaj düşüşünü kaydedin. Puls üretecini sırayla her bir elektroda ve salin çözeltisinde (fosfat tamponlu salin [PBS] 1x) bir platin sayacına bağlayın. Ayarlar için adım 3.1’e bakın. Elektrokimyasal empedans spektrogramı: Bir potansiyometre kullanarak farklı frekanslarda elektrokimyasal empedansı ölçün. Platin sayacı ve tuzlu su çözeltisinde (PBS 1x) bir Ag/AgCl referans elektrodu kullanarak potansiyometreyi her bir elektrota sırayla bağlayın. Ayarlar için adım 3.2’ye bakın. Kanallar arası direnç: Kuru durumda, el tipi bir multimetre kullanarak bitişik kanallar arasındaki doğru akım (DC) direncini ölçün. İmplant seçimi: Yukarıda belirtilen üç ölçümden sonra, aşağıdaki kriterlerle birlikte implantı seçin: 100 kΩ’un altında 1 kHz’de empedans ve 1 MΩ’un altında kanallar arası direnç yok. Sterilizasyonİmplant sterilizasyonu: Seçilen implantları bir sterilizasyon işaretleyicisi ile birlikte tek tek sterilizasyon torbalarına yerleştirin ve kapatın. Ameliyat sırasında steriliteyi sağlamak için çift ambalaj kullanın.NOT: Bu durumda, kısa zaman döngüsü ve düşük sıcaklık (55 °C) nedeniyle hidrojen peroksit (H 2 O2) gaz sterilizasyonu kullanılır. Alternatifler etilen oksit (ETO) gazı veya otoklav sterilizasyonudur ancak implant sistemi ile uyumluluk sağlanmalıdır. Alet sterilizasyonu: Temizlenen aletleri sterilizasyon işaretleyicileri ile birlikte çift sterilizasyon torbalarına veya steril alet kutularına yerleştirin. Otoklav sterilizasyonu aletler için en yaygın olanıdır, ancakH 2 O2 veya ETO olası alternatiflerdir. 2. Yumuşak ECoG dizilerinin cerrahi implantasyonu AnesteziPremedikasyon: Hayvanı izole edin ve gece boyunca aç bırakın. İntradermal olarak 0.75 mg / kg’da midazolam, 0.25 μg / kg’da atropin ve 0.1 mg / kg’da haldol karışımı enjekte edin ve hayvan sakinleşene kadar bekleyin. Devam etmeden önce hayvanı tartın. İntravenöz (IV) kurşunun montajı:Hayvanı ameliyat masasına bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirin. % 3 -% 3.5 oranında sevofluran kullanarak hayvana bir yüz maskesi yerleştirerek anesteziyi indükleyin. Elektrokardiyogram uçlarını karnına, kuyruğa bir kan doygunluk sensörüne ve burun deliğine bir sıcaklık sensörüne yerleştirin. Kulak damarına bir IV ucu yerleştirin ve tuzlu suyla dolu bir şırınga kullanarak kan erişimini onaylayın. Merhem kullanarak gözlerin nemli kalmasını sağlayın. Entübasyon: 0.5 mg / kg’da bir atrakuryum bolusu, 1 mg / kg’da ketamin ve 1-2 μg / kg’da fentanil enjekte edin. Entübasyon için hayvanı sırtına yerleştirin. 4,5 mm’lik bir tüp yerleştirin. İlaç tedavisi: Entübasyondan sonra sevofluran anestezisini durdurun ve 10 mg/kg/saat’te propofol infüzyonu, 2 μg/kg/saat’te fentanil, 0.2-0.5 mg/kg/saat’te atrakuryum ve 4-7 mg/kg/saat’te salin infüzyonu uygulayın. Ameliyat sırasında beyin şişmesini azaltmak için 1 g / kg / s’de bir mannitol infüzyonu başlatın.NOT: Yerel hayvan etik kurulu tarafından önerildiği takdirde multimodal analjezi rejimi kullanılabilir. Ameliyat öncesi röntgenHayvanı sfenks pozisyonunda karnına yerleştirin. Hayvanın beyninin ve kafatasının yakınındaki herhangi bir metal nesneyi geçici olarak çıkarın (örneğin, burun deliğindeki sıcaklık kurşunu). Kemiğin kontrastı ile eksenel ve sagital düzlem röntgeni elde edin. Beynin önündeki ve arkasındaki kafatası kalınlığını ölçmek için bir ölçek görevi görmesi için sagital edinim alanına bilinen boyutlara sahip metalik bir nesne yerleştirin. Frontal sinüslerin yerini belirleyin (kafatasının altındaki boşluklarla görülebilir) ve kalıcı bir işaretleyici kullanarak hayvanın kafasındaki en arka yeri işaretleyin. Bu, aşağıda açıklanan cerrahi yaklaşımda herhangi bir kraniyotomi veya vida yerleştirmenin yapılabileceği en uzak noktayı gösterecektir. Aseptik alan ve cilt hazırlığı: Başın tüm yüzeyini cerrahi alanın ötesinde tıraş edin. Steril bir ped kullanarak, kafayı betadin ile iyice ovalayın. Ardından, sadece cerrahi pencereyi ortaya çıkarmak için steril örtüleri enstrümantasyon masasına ve hayvanın üzerine yerleştirin. Son olarak, betadin kullanarak kafayı tekrar steril bir ped ile ovalayın. Kraniyotomi ve durotomiCilt kesimi: Cildi orta hat boyunca bir neşter bıçağıyla kesin. Kas ve periosteuumu (her iki tarafta bregmadan yanal olarak 25 mm ve bregmanın 40 mm ön ve arkasında) bir raspatory kullanarak kemikten ayırın ve daha sonra delme için optimum erişim elde etmek için yayıcıları yerleştirin. Ölçümler ve işaretleme: Bregma ve lambda’yı tanımlayın ve steril bir cerrahi kalemle işaretleyin (Şekil 2A, B). Steril bir cetvel kullanarak, her iki hemisferde implantasyon hedefi etrafında ortalanmış kemik flebi taslağını tanımlayın. Bu özel durumda, işitsel korteks, bregmadan -5 mm ila -15 mm ve lateral olarak -4 mm ila -20 mm koordinatları ile seçildi. Ardından, kraniyotomiyi implantın boyutuna ve anatomik işaretlere göre ayarlayın ve açıklık boyutunu sınırlayın. Kraniyotomi:Yuvarlak bir kesme ucuna sahip bir kemik matkabı kullanarak, adım 2.2’de ölçülen kafatasının kalınlığını dikkate alarak kraniotominin ana hatlarını delin. Kemiğin aşırı ısınmasını önlemek için delme yerini tuzlu su çözeltisiyle sulayın. Anahattı dura mater’e ulaşana kadar homojen bir şekilde dikkatlice delin. İlk atılımda, neredeyse kırılacak kadar inceltilene kadar anahattı delmeyi bitirin. Ardından, kraniyotomi kenarını kaldıraç olarak kullanarak kemik flebini tek parça halinde kırmak için düz bir spatula (orta hat tarafında veya yan tarafta) kullanın. Çok fazla dirençle karşılaşılırsa, kemiği inceltmeye devam edin. Kemik parçasını steril tuzlu suya yerleştirin. Kemik flebi çıkarıldıktan sonra, keskin kemik kenarının dura mater’i kesmesini önlemek için bir Kerison kullanarak kraniotominin kenarını dikkatlice kırın. Dura mater veya kemikte aşırı kanama ile karşılaşılırsa, sırasıyla Jel Köpük veya kemik mumu kullanın. Kraniotomiye ıslak bir kompres (steril salin solüsyonunda standart ped) yerleştirin ve bu adımı diğer hemisferde tekrarlayın (Şekil 2B). Durotomi:6-0 dikiş kitindeki iğneyi kullanarak, kraniyotominin ön veya arka ucundaki dura mater’i medial ve lateral taraf arasında dikkatlice delin ve kaldırın ve bıçak bıçağıyla bir kesi başlangıcı oluşturun. Daha sonra, korteksi korumak için bir kesme tabanı görevi gören subdural boşluğa yerleştirilen küçük düz bir spatula kullanarak, her iki aletle aynı anda ilerleyerek dura materde bir ön-arka yarık oluşturun. Yarığın implantın genişliğinden biraz daha büyük olduğundan emin olun (Şekil 2C). Bu adımda herhangi bir kanama veya hasar meydana gelirse, jel köpük ile örtün ve durana kadar bekleyin.NOT: Kanamayı önlemek için dura materde büyük kan damarları mevcutsa, yarık yörüngesi uyarlanmalıdır. ImplantasyonuCihaz yerleştirme:İmplantı (Ek Şekil 1A) her iki taraftan salinle sulayın, böylece subdural boşluğa daha kolay kayar. İmplantı dura mater yarığın üzerine yerleştirin ve küçük forsepslerle cihazı her bir kenarda sırayla kaydırarak subdural olarak yerleştirin. Cihazın kaide ucunu dikkatlice tutun ve yerleştirmeyi engelleyen gerginlik oluşturmamak için implantla ilerleyin. Konektör kenarı yarığın üstüne yerleştirildiğinde, yerleştirmeyi durdurun. İmplantı sabitleyin: İmplantı yerine sabitlemek için, kraniyotominin kenarından sonra veya ankraj kanatlarına kablonun üzerine titanyum bir köprü yerleştirin ve uygun tornavidayı kullanarak bir veya iki titanyum vidayla sabitleyin (Şekil 2D). Zemin yerleşimi: Topraklama kablolarının yalıtımının 1 cm’sini dikkatlice çıkarın ve kraniotominin arka ucuna (veya ilgilenilen korteksten veya büyük kan damarlarından uzaktaki herhangi bir epidural konuma) epidural olarak yerleştirin ( Şekil 2E’deki tel) 2.4.4 adımlarını tekrarlayın. ve kontra-lateral yarımkürede 2.5.1.-2.5.3. Yerleşimi doğrulamak için intraoperatif röntgen:Dokuyu nemli tutmak için ameliyat yerinin üzerine ıslak bir ped (steril salin solüsyonunda standart ped) yerleştirin. Ardından, hayvanın başını örtmek için steril bir ameliyat örtüsü yerleştirin. X-ışını işaretleyicilerini gösterge olarak kullanarak implantların iyi yerleştirildiğinden ve katlanmadığından emin olmak için düzlem röntgen görüntüleri (eksenel ve sagital) alın. Değilse, örtüyü çıkarın ve tekrar takmak için cihazı çıkarın (2.4.4. ve 2.5.1.-2.5.3 adımlarını tekrar izleyin). Dura mater kapatma: 3-0 emilebilir bir sütür ve küçük bir iğne tutucu kullanarak dura mater’i implant kablosunun etrafına dikkatlice dikin. Dikiş teli ile ince zarı yırtmadan iki dura mater kenarını mümkün olduğunca bir araya getirin (Şekil 2D, E). Kemik flebi yerleştirme: Bir titanyum vida kullanarak her kemik flebinin ön ve arka kısmına bir titanyum köprü sabitleyin. Sonraki adımlarda ayak plakası ayaklarının yerleşimine göre Ti-köprülerinin konumunu planlamaya dikkat edin. Titanyum köprülerin ucunu kafatasına vidalayın (Şekil 2F, G). Kaide ve ayak plakası yerleşimiKonumlandırma: Bu konfigürasyonda, ayak plakasının her biri iki vida deliği olan altı ayağı vardır (Ek Şekil 1B). Vidaların yerini optimize etmek için ayak plakasının kafatası üzerindeki yerleşimini planlayın (bunları kraniotominin kenarına veya temporal kasın içine yerleştirmekten kaçının). Vidalanamıyorlarsa bacaklardaki delikleri atlayın. Ayak plakası sabitleme: Ayak plakasının titanyum vidalarını sıkıca yerine oturana kadar vidalayın (bkz. Şekil 2H). Kaide yerleşimi: Bağlantı kablolarının üzerindeki titanyum köprüleri çıkarın ve ayak plakasına inmek için kaidenin üzerinden çevirin. Kaideyi ayak plakasına vidalayın. Kaidenin sıkıca yerine oturduğunu kontrol edin (Şekil 2I). Dikiş ve kapatmaYaranın temizlenmesi: Herhangi bir kemiğin veya diğer kalıntıların deri altı boşluğunu tuzlu su ile yıkayarak temizleyin. Silindiri takip eden yuvarlak bir kenar oluşturmak için kaide kenarlarının etrafındaki bir miktar deriyi kesin. Deri altı dikişler: Yayıcıları çıkarın ve cilt fleplerini birlikte katlayın. Basit kesintili dikişler veya basit sürekli dikişler kullanarak 3 mm aralıklarla 4-0 emilemeyen sütür teli ile cilt altı sütürler oluşturun. Kesiden uzaklaşın, insizyonun her iki tarafında ona doğru hareket edin. Dermal sütürler: 6-0 emilemeyen sütür teli kullanarak, dikişler 5 mm aralıklarla cildi dikin. Kesiden uzaklaşın, insizyonun her iki tarafında ona doğru hareket edin. Bir boşluğu önlemek için iki cilt flebi arasında ve kaide kenarına yakın iyi bir doku yerleşimi elde etmeye özen gösterin (Şekil 2J). Yara pansumanı: Yara bölgesini steril bir ped ve betadin ile tekrar temizleyin. Yaranın üzerine kendinden yapışkanlı steril bir bandaj uygulayın. İn vivo ölçümler: İn vivo ölçümler için bölüm 3, 4 ve 5’i izleyin. Uyanış: Tüm ölçümler yapıldıktan sonra, hayvanı tüm anesteziklerden çıkarın, ancak havalandırma altında tutun. Analjezi için, 24 saat boyunca bir buprenorfin bandı (25 mg / saat) uygulayın. Uyanma süresini hızlandırmak için hayvanı perdelerle kaplı bir ısıtma yastığına yerleştirin. Spontan solunum geri kazanıldığında, hayvanı ekstübe edin ve bilinç geri gelene kadar (1 ila 4 saat sürebilir) bir oksijen yüz maskesi altına koyun. Ameliyat sonrası hayvan bakımı: 5 gün boyunca hayvanı yakın gözetim altında tutun. Diğer hayvanlardan ayrılmış, günde iki kez 75 mg’da bir doz sefaleksin verin. Islatılmış steril pedlerle bol miktarda betadin uygulayarak (en iyi beslenme sırasında yapılır) yaranın dezenfeksiyonunu günlük olarak gerçekleştirin.NOT: Uzun süreli bakım ve barınma: Ameliyat edilen hayvan 24 saat izole tutulur. Hayvan, akranlarıyla sosyal olarak etkileşime girecek kadar iyiyse, orijinal sosyal grubuna geri konur. Cihazın kafaya entegrasyonunu takip etmek için kaide ve cilt açıklığının günlük gözlemi yapılmalıdır. Uygun olduğunda, kaidenin etrafındaki yeri bol miktarda betadin ile temizleyin. 3. Yumuşak implantın in vivo karakterizasyonu Kronoamperometri: Bir darbe üretecine paralel bağlanmış bir osiloskop kullanarak bifazik bir akım darbe evriminin (yani VT) enjeksiyonu üzerine voltaj düşüşünü kaydedin. Darbe üretecini sırayla her elektroda ve topraklama kablosuna bağlayın. Stimülasyon darbesini 100 Hz’de 300 μs darbe genişliği ile 100 μA’da gerçekleştirin. Elektrokimyasal empedans spektroskopisi: Bir potansiyometre kullanarak elektrokimyasal empedansı farklı frekanslarda ölçün. Topraklama kablosunu hem karşı elektrot hem de toprak olarak kullanarak darbe üretecini her elektroda sırayla bağlayın. Uyarma voltajını 200 mV’a ve frekans aralığını 1 Hz ila 1 MHz arasında, on yılda üç nokta olacak şekilde ayarlayın. Kanallar arası kısa ölçümler: El tipi bir multimetre kullanarak bitişik kanallar arasındaki DC direncini ölçün. İn vivo, kanallar arası DC direnci yalnızca 1 kΩ’un altında herhangi bir eksiklik görünmediğini doğrulamak için ölçülür, bu da toplam kapsülleme hatasını gösterir. 4. Elektrofizyolojik kayıt Spontan aktivite: Kablosuz kayıt sistemini kaideden geçirin ve temel aktiviteyi 2-3 dakika boyunca kaydedin. Bu kayıtlar, işitsel uyarılmış potansiyelleri analiz etmek için bir kontrol görevi görecektir. İşitsel uyarılmış potansiyeller: Kablosuz sisteme ek olarak, hoparlörleri hayvan kulaklarında kapalı bir alana yerleştirin. 200 tekrardan fazla yaklaşık 20,000 dB ses basıncı seviyesinde (SPL) farklı frekanslarda (70-120 Hz arasında değişen) ses patlaması akustik stimülasyonu çalın. Ardından, kayıtların ortalamasını alın ve analiz için uyaran süresi boyunca hizalayın. Duyusal uyarılmış potansiyeller: İğneleri buruna üç farklı pozisyonda yerleştirin. İşe alım eğrilerini elde etmek için farklı genliklerde nabız üreteci ile burnu ~30 saniye uyararak duyusal potansiyelleri uyandırın. 5. İn vivo görüntüleme Hayvan taşıma: Hayvanı adım 2.1’de açıklandığı gibi propofol anestezisi altında tutun. Hayvanı ameliyathaneden görüntüleme tesislerine ve geri taşımak için ventilatör, şırınga pompası ve yaşamsal belirti monitörü barındıran bir taşıma arabası kullanın. Bilgisayarlı tomografi röntgen taraması: Hayvanı tarayıcı masasına yerleştirin ve başın etrafındaki metal nesneleri (örn. sıcaklık sensörü) çıkarın. Kemik kontrastı için otomatik akım ve voltaj seçimi ile izometrik toplama kullanarak en küçük çözünürlükte (0,4 mm dilim kalınlığı) bir BT taraması elde edin. Manyetik rezonans görüntüleme: Metal içeren tüm ekipmanı hayvandan çıkarın (MRI uyumlu IV uçları ve entübasyon tüpü kullanın). MRI odasının dışında bulunan ve uzun bir tüp aracılığıyla hayvana bağlanan bir ventilatör kullanarak hayvanı havalandırın ve sevofluran altında% 3 -% 3.5’te uyuşturun. İlk sekanstan önce, 1-2 μg/kg’da bir bolus fentanil enjekte edin. En küçük çözünürlükte üç izometrik dizi kullanın: T1-, T2- ve turbo spin eko (TSE) ağırlıklı diziler ( Ek Dosya 1’de gösterilen parametreler). 6. Serbestçe hareket eden kayıt Beyinden gelen uyanık sinyalleri kaydetmek için bölüm 4’te açıklanan prosedürün aynısını izleyin. Hayvanı deneycinin kollarında tutarak veya dikkatini dağıtmak için hayvanı ikramlarla besleyerek kablosuz başlığı takın. Hayvanın yakınına yerleştirilmiş harici hoparlörleri kullanarak akustik stimülasyon sağlayın. 7. Perfüzyon ve doku hazırlama İSTEĞE BAĞLI: Hayvan zaten anestezi altında değilse, anestezi protokolü için adım 2.1’i izleyin. Perfüzyon için karotis artere kateter yerleştirilmesi (Ek Şekil 2)Karotis arter ve juguler ven diseksiyonu: Bir koterizatör / kesici kullanarak boğazı orta hatta kesin. Önce deriyi, sonra orta beyaz çizgiyi takip eden kası kesin (altında damar yok) (Ek Şekil 2A). Trakea çevresinde ve kasın altında boşluk açmak için parmaklarınızı kullanarak daha fazla açın. Karotis arteri arayın (dayak ve pembemsi); Vagal sinir bazen de etrafındadır (beyaz) ve juguler ven altında veya yanda (kırmızı) olabilir. Yayıcıları yerleştirin (bkz. Ek Şekil 2B). İnce forseps ve yuvarlak makas kullanarak karotis arterin diseksiyonunu başlatın. Konjonktif, dokuyu açmak için makas kullanın. Kan damarı yoksa kesin; kan damarları varsa, koterize edin ve ilerleyin (Ek Şekil 2C, D). Yeterince diseke edildiğinde, karotis arterin altına girmek için bir kelepçe kullanın, böylece tamamen izole edilir (Ek Şekil 2E). Aynı işlemi juguler ven için tekrarlayın (Ek Şekil 2F). Her iki damar da tamamen diseke edildiğinde ve izole edildiğinde, etraflarına dikiş teli yerleştirin. Henüz kapatmayın. Karotis çevresinde, biri en tabanda (beyin perfüzyonu için dikiş 1-kalp tarafı) ve diğeri diğer tarafta (sütür 2) olmak üzere iki sütür Ek Şekil 2G’de gösterilmiştir. Juguler venin etrafına bir dikiş yerleştirin (sütür 3), kapalı değil; Damarın daha sonra kesilmesi için telleri bantla işaretleyin. Dikiş 1’i çok sıkı bir şekilde kapatın, aksi takdirde kanar (Ek Şekil 2H). Üç düğüm bağlayın. Ağırlık koymak ve karotis arterde gerginlik oluşturmak için telin üzerine bir kelepçe yerleştirin. Karotis arter diseksiyonunun karşı tarafında bir damar kelepçesi kullanarak karotis arteri klempleyin (beyin perfüzyonu için beyin tarafı; Ek Şekil 2I). Dikiş 2 ortada, henüz kapanmadı. Karotis arteri yakalamak ve çekmek için siyah forseps kullanın. İnce makas kullanarak, karotis arterin yarısını diseksiyonun tabanına yakın bir yerde (sütür 1’in yakınında, kalp tarafı; bkz. Ek Şekil 2J). Bölümün mümkün olduğunca temiz olduğundan ve sadece “kılıfa” değil, geminin kendisine ulaştığından emin olun; Aksi takdirde, kateter geçmeyecektir. Kateteri Ek Şekil 2K’da gösterildiği gibi yerleştirin. Kateteri yıkayın ve önce PBS ile doldurun, böylece kateterde hava kalmaz (Ek Şekil 2K ek). Sütür 2’yi yeterince sıkı bir şekilde kapatın, böylece kaybolmaz, ancak kateterin hala biraz hareket edebilmesi için çok fazla değil (Ek Şekil 2L). Ardından, damar kelepçesini çıkarın, kateteri mümkün olduğunca yerleştirmeyi bitirin ve dikiş 2’nin kapanmasını tamamlayın (sıkıca kapatın). İstenirse, ekstra bir güvenlik adımı olarak yaranın çıkışında kateterin tabanını cilde tutturmak için dikiş 1’de dikiş telleri kullanın. Ardından, hayvanı perfüzyon bölgesine aktarın ve PBS / heparine takın. Perfüzyon başladığında sütür 3’ü çekin ve şah damarını kesin Ötenazi: Pentobarbital (90 mg / kg) intravenöz olarak verin ve tam dozun başarılı bir şekilde uygulandığından emin olmak için hattı salinle yıkayın. Perfüzyon: Bir perfüzyon pompası (200 mL/dak) kullanarak karotis kateteri PBS/heparine (15 kg’lık bir domuz için 1 L) ve ardından %4 paraformaldehit (PFA) içeren PBS’ye (15 kg’lık bir domuz için 5 L) takın. Perfüzyon başladığında sütür 3’ü çekin ve şah damarını kesin. Doku toplamaKafa kesme: Perfüzyon bittiğinde, bir neşter kullanarak, deriyi ve kası keserek ve bıçağı birinci ve ikinci omurlar arasına sokarak hayvanın kafasını vücuttan ayırın. Postfiksasyon: Kafayı 4 ° C’de 48 saat daha PBS’de% 4 PFA’ya daldırın ve ardından beyin ekstraksiyonundan önce PBS’ye aktarın. Beyin ve implant ekstraksiyonu:Bir neşter kullanarak cildi çıkarın ve omuriliği takip ederek beyinciğe kadar ilk omurlardan başlayarak bir rongeur kullanarak kemiği dikkatlice kesmeye başlayın. Beyincik açığa çıktığında, temporal kemikleri dikkatlice çıkarın ve parietal ve frontal lobları ortaya çıkarın. Bu noktada, kaideyi ayak plakasından vidalayın ve ayak plakasının ayaklarını pense ile kesin. İmplantları dura mater çıkışından dışarı çekmeden, implant sistemini kemikten kurtarmak için kafatasına kablo girişinin yakınındaki kemiği çıkarın. İmplant kabloları kemiğe gömülüyse, kabloyu çıkışa mümkün olduğunca yakın kesin. Yeterli beyin yüzeyi açığa çıktığında, küçük bir makas kullanarak orta hattı takip eden durayı dikkatlice kesin. İmplant kablolarını dura mater çıkışından kurtarın. Beyindeki implant yerleşiminden fotoğraflar çekin. Ardından, beyni aşağıdaki kraniyal sinirlerden ayırmak için küçük bir kaşık kullanın. Beyni dikkatlice çıkarın. İmplantları beyinden çıkarın. Beynin postfiksasyonu: Perfüzyon kalitesine bağlı olarak, ekstrakte edilen beyni 4 ° C’de PBS’de% 4 PFA’da 24 saat boyunca tekrar ekleyin. Beyin kesilene kadar 4 ° C’de 0.1 M PBS’de tutun. Beyin kesimi: Bir tıraş bıçağı kullanarak iki yarım küreyi ayırın. Ardından, beyni ortogonal olarak dört farklı parçaya kesin. İmplante edilen bölgeyi ve bir kontrol alanını içeren iki blok elde etmek için implante edilen bölgeyi ikiye bölün. Daha fazla kontrol slaytına ihtiyaç duyulursa diğer iki bloğu saklayın. Beyin kriyoproteksiyonu ve dondurma: Beyin bloklarını, beyin dalıp dengeye ulaşana kadar 4 ° C’de önce sakaroz ve ardından sükroz çözeltisine aktarın. Daha sonra izopentan içinde dokuyu -55 °C’de doku dondurma sisteminde dondurun. 8. Histoloji Doku kesitiKriyostat: Donmuş beyni bir kriyostata yerleştirin ve tam kesitler elde edilene kadar düzeltin. Daha sonra, beyni 40 μm’lik bölümlere ayırın ve 0.1 M PBS’de üçlü gruplar halinde kuyucuk plakalarına daldırın. Plakaların sırasını dikkatlice not edin. Kesit seçimi: Analiz edilecek bölgeye (implante edilen bölge veya kontrol bölgesi) bağlı olarak kesitleri seçin. Hasar olup olmadığını kontrol etmek için ince bir fırça kullanarak bölümleri kuyu plakalarından sırayla çıkarın. Daha fazla boyama için bunları 0,1 M PBS ile doldurulmuş yeni kuyu plakalarına yerleştirin. İmmünohistokimyaHazırlık: Kesitleri 15 dakika boyunca% 0.3 Triton X / PBS’de, ardından oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyunca% 3 sığır serum albümini (BSA) / PBS ile inkübe edin. Birincil antikorlar: Dokuları RT’de 48 saat boyunca birincil antikorlarla inkübe edin (anti-GFAP, sıçan, 1/300’de seyreltilmiş; anti Iba1, tavşan, 1/400’de seyreltilmiş; anti-NeuN, gineapig, 1/1.000’de seyreltilmiş; tümü% 1 BSA / PBS’de). Kuyu plakalarını alüminyum folyo ile örtün. Yıkama: Kuyuları 0,1 M PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. İkincil antikorlar: Dokuları RT’de 2 saat boyunca ikincil antikorlarla inkübe edin (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 555; tümü% 1 BSA / PBS’de 1/400’de seyreltilir). DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol): Dokuları DAPI ile 15 dakika inkübe edin (% 1 BSA / PBS’de 1 / 1.000). Yıkama: Kuyucukları 0.1 M PBS ile 15 dakika boyunca beş kez yıkayın. Montaj: Kızakları montaj ortamı ve lamel kullanarak monte edin. Slaytları karanlıkta buzdolabında 4 °C’de saklayın. GörüntülemeTüm slayt görüntüleme: Üç farklı dalga boyunda (640 nm, 560 nm, 485 nm) bir slayt tarayıcı mikroskobu kullanarak slaytları 10x büyütmede (objektif çalışma mesafesi değeri = 3.100 μm) görüntüleyin. Tüm güç ve kazanç bilgileri Ek Dosya 2’de bulunabilir. Mikroskobik görüntüleme: Dört dalga boyunda (Alexa Fluor 647, DAPI, Cy3, EGFP) konfokal bir mikroskop kullanarak ilgilenilen bölgeyi 20x büyütmede (apokromat 20x/0.8 M27) görüntüleyin. Tüm güç ve kazanç bilgileri Ek Dosya 3’te bulunabilir.