Imágenes de una sola molécula de la movilidad lateral y la actividad del canal iónico en bicapas lipídicas utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)

1. Producción de proteínas NOTA: Esta sección describe el procedimiento para aislar OmpF de Escherichia coli BE BL21(DE3) omp631,32, que carece de LamB y OmpC, y el complejo central TOM de Neurospora crassa (Figura 1)28,29. Este último requiere mitocondrias aisladas de una cepa 28 de N. crassa que contiene una forma marcada con 6xHis de la subunidad TOM Tom22 (Figura 1A), que puede aislarse como se describe28. Los siguientes protocolos generalmente producen 1-2 mg de N. crassa TOM-CC y 10 mg de E. coli OmpF. Si se va a ajustar la cantidad, es importante que las proporciones proteína/detergente se mantengan con precisión. A menos que se especifique lo contrario, todos los pasos deben realizarse a 4 °C. Aislamiento del complejo central TOMSolubilizar mitocondrias purificadas de N. crassa (2 g de proteína) obtenidas por sedimentación diferencial a partir de hifas de aproximadamente 1,5 kg (peso húmedo), según Bausewein et al.30, a una concentración proteica de 10 mg/mL en 20 mM de Tris-HCl (pH 8,5), 1% (p/v) DDM, 20% (v/v) de glicerol, 300 mM de NaCl, 20 mM de imidazol y 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante 30 min a 4 °C.PRECAUCIÓN: El PMSF es tóxico. Use equipo de protección personal adecuado. Transfiera las mitocondrias solubilizadas a tubos de ultracentrífuga y separe las membranas no solubilizadas de las proteínas de membrana solubilizadas mediante ultracentrifugación a 130.000 x g durante 40 min a 4 °C y filtración con papel de filtro de grado estándar. Equilibre una columna de Ni-NTA preempaquetada (volumen de 5 ml) con aproximadamente 5 volúmenes de columna (CV) de tampón A1 (Tabla 1) utilizando un sistema automatizado de purificación de proteínas. Haga funcionar la columna de Ni-NTA a un caudal constante de 1 ml/min durante todos los pasos. Use una columna de volumen más bajo (1 ml) si las proteínas se han aislado de menos de 2 g de mitocondrias. Cargue la muestra de proteína solubilizada en la columna de Ni-NTA a un caudal de 1 ml/min. Lave la columna de Ni-NTA con 5 CV de tampón A1 (Tabla 1) para eliminar las proteínas no unidas. Eluir TOM-CC marcado con Tampón A2 al 30% (Tabla 1; imidazol 300 mM) y recoger el pico de proteína tal como aparece en el cromatograma de 280 nm (Figura 1B). Para una mayor purificación de TOM-CC, equilibre la columna de intercambio aniónico preempaquetada (1 ml) con 5 CV cada una de tampón B1, B2 y B1 (Tabla 1) utilizando el sistema automatizado de purificación de proteínas. Hacer funcionar la columna de intercambio aniónico a un caudal constante de 1 ml/min durante todos los pasos. Cargue la fracción de pico TOM-CC (paso 1.1.6) en la columna de intercambio aniónico (caudal de 1 ml/min). Eliminar las proteínas no unidas lavando la columna con 5 CV de tampón B1 (Tabla 1) y un gradiente lineal de sal de 0%-20% tampón B2 (Tabla 1). Eluya TOM-CC con un gradiente de sal lineal de 20%-35% tampón B2, y recoja la fracción pico de proteína tal como aparece en el cromatograma de 280 nm (Figura 1C). Evalúe la pureza de la muestra mediante SDS-PAGE (Figura 1D) y determine la concentración de proteína utilizando un ensayo de proteínas disponible comercialmente, de acuerdo con el protocolo del fabricante (consulte la Tabla de materiales). Congelar las muestras de proteínas en nitrógeno líquido y almacenarlas a -80 °C hasta su posterior uso.PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido debe manipularse en áreas bien ventiladas. Use equipo de protección personal adecuado.   Aislamiento de OmpFRecuperar la cepa de E. coli BE BL21(DE3) omp6, que carece de LamB y OmpC32, de una cepa de glicerol congelada en condiciones estériles, y rayar en una placa de agar Luria-Bertani (LB) (Tabla 2). Para hacer esto, extienda gradualmente la muestra uniformemente sobre toda la placa. Dejar que la muestra penetre en el agar durante 5 minutos, antes de invertir la placa con la tapa cerrada e incubar durante la noche a 37 °C. Seleccionar una sola colonia de E. coli , inocular 7,5 mL de medio LB (Tabla 2) con esta colonia única utilizando un palillo estéril, y dejar crecer durante la noche (14 h) con agitación (170 rpm) a 37 °C. Transfiera 2 x 1 ml de células de E. coli con pipetas estériles a 2 x 500 ml de medio LB (Tabla 2), y deje crecer durante la noche (~ 14 h) a 37 ° C con agitación (~ 170 rpm) en un agitador. Cosechar las células por centrifugación a 5.000 x g durante 20 min a 4 °C, congelar el pellet en nitrógeno líquido y almacenar a -80 °C hasta su uso posterior.NOTA: El peso húmedo del pellet celular es típicamente de 5 g por 1 L de cultivo. En este punto, el protocolo se puede pausar. Descongele y resuspenda las celdas (2 g) en 20 ml de tampón de lisis C1 (Tabla 2), y pase la suspensión tres veces a 1,000 psi a través de un sistema de interrupción de celda de alta presión preenfriado (4 ° C), con un volumen máximo de muestra de 35 ml, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.PRECAUCIÓN: El uso de una prensa francesa puede provocar lesiones graves. Nunca exceda el límite de presión de la celda utilizada. Use equipo de protección personal adecuado. Retire las células intactas del lisado por centrifugación a 4.000 x g durante 15 minutos y recoja el sobrenadante. Recoger las membranas por ultracentrifugación a 100.000 x g durante 1 h. Resuspender el pellet de membrana en 10 ml de tampón C2 (Tabla 2) y mezclar con un volumen igual de tampón SDS C3 (Tabla 2) utilizando un homogeneizador de vidrio con rodamiento de bolas.PRECAUCIÓN: El β-mercaptoetanol en el tampón C3 es tóxico. Siga todas las normas de seguridad pertinentes. Incubar la suspensión en un baño maría a 50 °C durante 30 min. Centrifugar la muestra a 100.000 g a 20 °C durante 1 h. Resuspender el pellet de membrana en 10 ml de tampón C4 de SDS (Tabla 2) utilizando un homogeneizador de vidrio con rodamiento de bolas, e incubar la suspensión en un baño de agua a 37 °C durante 30 min.NOTA: Si el pellet no se puede resuspender, agregue más tampón SDS C4 hasta un volumen de 20 ml. Centrifugar la muestra a 100.000 g a 20 °C durante 30 min, y recoger el sobrenadante. Mezclar el sobrenadante con polioxietileno octilo (octil POE) hasta obtener una concentración final de detergente del 0,5% (p/v) y dializar la muestra dos veces contra el tampón C5 (Tabla 2) a 4 °C durante 24 h. Para este propósito, use un tubo de diálisis con un corte de 20 kDa, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y coloque la muestra en el tubo o dispositivo de diálisis.NOTA: El corte del tubo de diálisis debe ajustarse en caso de que las proteínas con otras masas moleculares se dialicen. Evalúe la pureza de la muestra mediante SDS-PAGE y determine la concentración de proteína utilizando un ensayo de proteína disponible comercialmente, de acuerdo con el protocolo del fabricante (Tabla de materiales).NOTA: Las muestras calentadas a 95 °C muestran OmpF monomérico. Las muestras no calentadas muestran OmpF en su forma trimérica (Figura 1F). OmpF dializado por choque y congelación en alícuotas en nitrógeno líquido, y almacenar a -20 °C hasta su uso posterior.PRECAUCIÓN: El nitrógeno líquido debe manipularse en áreas bien ventiladas. Use equipo de protección personal adecuado. 2. Registro óptico monocanal de canales iónicos en membranas DIB NOTA: Esta sección describe el procedimiento para preparar membranas DIB en cámaras microfabricadas de polimetacrilato de metilo (PMMA)2 para monitorear el movimiento lateral de proteínas y el flujo iónico a través de canales iónicos individuales17. Las dimensiones y los dibujos exactos para la fabricación de la cámara se pueden encontrar en Lepthin et al.2. La figura 2 ofrece una visión general del montaje de la cámara 2 de PMMAy la formación de las membranas DIB. A menos que se especifique lo contrario, todos los pasos se realizan a temperatura ambiente (RT). La Figura 3 muestra una representación esquemática de una membrana DIB y cómo el flujo de Ca2+ a través de una proteína de un solo canal se utiliza para monitorear tanto el movimiento en la membrana como el estado abierto-cerrado del canal. Preparación de lípidosExtraer del congelador la solución madre lipídica que contiene 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (25 mg/ml de DPhPC) disuelta en cloroformo a -20 °C y calentarla a RT. Para este propósito, generalmente es suficiente calentar la muestra lentamente a mano durante unos minutos.PRECAUCIÓN: El cloroformo es tóxico. Use el equipo de protección personal adecuado y realice todos los procedimientos que involucren cloroformo debajo de una campana extractora. Transfiera 380 μL de solución madre de DPhPC (25 mg/ml de DPhPC) a un vial de vidrio. Evite las pipetas con sellados de goma. En su lugar, use jeringas de vidrio de microlitros con émbolos de acero inoxidable. Después de manipular la solución de reserva lipídica, cubra la solución de reserva lipídica con gas Ar o N2 para evitar la oxidación lipídica. Utilice el flujo de gas más bajo posible para evitar la evaporación del disolvente orgánico en el que se disuelven los lípidos o las salpicaduras de los aerosoles de disolvente del vial. Asegúrese de que las tapas de los viales de vidrio que contienen lípidos con disolvente orgánico estén recubiertas con politetrafluoroetileno (PTFE) en el interior. Secar la muestra lipídica (paso 2.1.2) bajo una corriente deN2 y extraer el disolvente orgánico restante de la muestra de lípidos durante la noche al vacío (2,0 mbar) utilizando una bomba de vacío exenta de aceite. Disuelva la película lipídica en una solución de aceite de hexadecano/silicona agregando volúmenes iguales de hexadecano y aceite de silicona (500 μL cada uno) utilizando una jeringa de vidrio de microlitros hasta una concentración lipídica final de 9,5 mg/ml.NOTA: La solución lipídica es estable en RT durante varias semanas. Preparación de hidrogel de agarosaPrepare aproximadamente 1 ml de solución de agarosa de bajo punto de fusión (0,75% [p/v]) en agua desionizada doble, y caliente a 85 °C en un bloque de calentamiento durante 20 minutos para utilizarlo para recubrir el recubrimiento de vidrio por centrifugado.NOTA: La solución de agarosa se puede mantener en RT durante varias semanas y se puede recalentar varias veces. Preparar una solución de agarosa de bajo punto de fusión al 2,5% (p/v) en 0,66 M CaCl 2 y 8,8 mM HEPES (pH7,2 ), y calentar a 85 °C en un bloque de calentamiento durante 20 min. Asegúrese de que la agarosa esté bien derretida.NOTA: La solución de agarosa se puede conservar durante varias semanas en RT y se puede recalentar varias veces, al igual que la agarosa (paso 2.2.1) utilizada para el recubrimiento por centrifugado. Ensamblaje de la cámara de polimetacrilato de metilo (PMMA) y formación de monocapa lipídica en la interfaz hidrogel hexadecano/aceite de siliconaColoque algunos cubreobjetos de vidrio (40 mm x 24 mm x 0,13 mm) en un soporte de acero inoxidable y límpielos en un vaso de precipitados de vidrio durante 10 minutos con acetona en un limpiador ultrasónico. Use la acetona suficiente para sumergir los cubreobjetos y cubra el vaso de precipitados holgadamente con una placa de vidrio para crear un sistema cerrado y sin presión que minimice el escape de vapores durante el proceso de limpieza.PRECAUCIÓN: La acetona es un disolvente altamente inflamable con un bajo punto de inflamación. Las mezclas vapor/aire son explosivas. Opere el limpiador ultrasónico en un área bien ventilada. Use el equipo de protección personal adecuado y observe las precauciones de seguridad oficiales (por ejemplo, sin llamas abiertas ni chispas). Enjuague los cubreobjetos de vidrio con agua de doble desionización y séquelos bajo una corriente de N2.NOTA: Los cubreobjetos limpiados de esta manera se pueden almacenar durante varias semanas. Limpie e hidrophilice aún más un cubreobjetos en un limpiador de plasma con oxígeno (0,5 mbar) durante 5 min.NOTA: Realice este paso inmediatamente antes del recubrimiento por centrifugado con solución de agarosa, ya que el efecto hidrófilo de la limpieza con plasma desaparece con el tiempo. Monte un cubreobjetos tratados con plasma en una recubridora de centrifugado (Figura 2, paso 1). Cubra el cubreobjetos con una película de agarosa de espesor submicrométrico añadiendo lentamente 140 μL de agarosa calentada de bajo punto de fusión al 0,75% (p/v) (paso 2.2.1) a 3.000 rpm durante 30 s, utilizando una pipeta de 200 μL (figura 2, paso 1).NOTA: El espesor de la película de agarosa puede determinarse mediante microscopía de fuerza atómica (AFM), como se describe17. Fije inmediatamente el cubreobjetos recubierto de centrifugado con la capa delgada del hidrogel de agarosa a la parte inferior de la cámara 2 de PMMA. Asegúrese de que el hidrogel de agarosa apunte hacia arriba (Figura 2, paso 2). Fije los bordes del cubreobjetos al dispositivo micromecanizado de PMMA con cinta adhesiva transparente. Coloque el dispositivo de PMMA en una placa caliente calentada a 35 °C (Figura 2, paso 3). Vierta cuidadosamente 200 μL de solución de agarosa al 2,5% (paso 2.2.2) en la entrada de la cámara con una pipeta (Figura 2, paso 3), sin crear burbujas de aire para que el hidrogel delgado aplicado por recubrimiento de centrifugado pueda equilibrarse con el tampón de la solución de agarosa al 2,5% y permanecer hidratado. Asegúrese de que la solución de agarosa al 2,5% se extienda alrededor del hidrogel de agarosa recubierto por centrifugado, pero no sobre él (Figura 3A), lo que se puede evitar presionando suavemente la cámara de PMMA sobre la placa calefactora. Cubrir inmediatamente los pocillos de la cámara de PMMA (Figura 2, paso 4) con un total de 60 μL de solución lipídica/aceite (paso 2.1.5), para iniciar la formación de monocapa lipídica en la interfaz agarosa-aceite y evitar la deshidratación de la agarosa recubierta de espín en los pocillos de la cámara de PMMA. Mantener el dispositivo en una placa caliente a 35 °C durante aproximadamente 2 h.NOTA: Los pocillos circulares en la cámara de PMMA tienen un diámetro de 0,5 mm y una profundidad de 1,8 mm, según el trabajo publicado anteriormente2. Preparación de gotitas acuosas recubiertas de lípidos en solución de aceite de hexadecano/siliconaColocar 20 μL de solución lipídica de hexadecano/aceite de silicona (paso 2.1.5) en cada uno de los varios pocillos microfabricados en una cámara de incubación de gotitas (figura 2, paso 4). Los recipientes adecuados para la solución lipídica de hexadecano/aceite de silicona son pequeños huecos de 40 mm x 30 mm x 3,5 mm en una placa delgada de PMMA2. Prepare una aguja de vidrio microcapilar con un diámetro de abertura de punta de 20 μm utilizando un extractor de micropipetas vertical u horizontal (por ejemplo, utilizado para hacer pipetas de parche o electrodos de vidrio afilados). Estimar el diámetro de apertura de la aguja de vidrio microcapilar bajo un microscopio estereoscópico binocular a bajo aumento, en un rango de zoom entre 7.5x y 35x.NOTA: Los ajustes para el modo de precalentamiento antes de tirar del capilar de vidrio, el modo de calentamiento para tirar y la fuerza de tracción deben determinarse experimentalmente de antemano, de acuerdo con las especificaciones del fabricante del dispositivo de tracción y el tipo de capilar. Llene la aguja de vidrio microcapilar con 5 μL de solución inyectable acuosa que contenga 8,8 mM HEPES (pH 7,2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1,32 M KCl y 30 nM TOM core complex, o alternativamente 20 nM OmpF utilizando una punta de pipeta microcapilar. Use solo agua doble destilada previamente tratada con una resina quelante que se une a iones metálicos multivalentes (Ca2+) para preparar la solución de inyección acuosa. Monte la aguja de vidrio microcapilar con la solución de inyección acuosa en un nanoinyector piezoeléctrico. Inyectar 100-200 nL de gotitas acuosas (Figura 2, paso 4) que contengan 8,8 mM HEPES (pH 7,2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1,32 M KCl y 30 nM TOM core complex (paso 1.1.12), o alternativamente 20 nM OmpF (paso 1.2.16) en los pocillos de la cámara de incubación de gotitas llena de solución lipídica de hexadecano/aceite de silicona (ver 2.1.5) utilizando el nanoinyector. Asegúrese de que las gotitas no se toquen entre sí colocándolas a varios milímetros (>10 mm) de distancia en los pocillos. De lo contrario, si las monocapas lipídicas aún no se han formado en la interfaz aceite/tampón, se fusionarán en gotas más grandes.NOTA: Si no se dispone de capilares de clase ni nanoinyectores, las gotitas pueden prepararse alternativamente manualmente con pipetas de microlitros de un solo canal para volúmenes entre 0,1 μL y 0,5 μL, como se describe2. En este caso, sin embargo, los volúmenes de gotas no son tan precisos. Permitir la formación de una monocapa lipídica en la interfaz gota/aceite durante aproximadamente 2 h manteniendo las cámaras de incubación de PMMA y gotas (Figura 2, paso 4) en una placa caliente calentada a 35 °C. Preparación e imagen de canales iónicos individuales en membranas DIBTransfiera manualmente gotitas acuosas individuales desde los pocillos de la cámara de incubación de gotas bajo un microscopio estereoscópico a los pocillos de la cámara de PMMA (Figura 2, paso 5), utilizando una pipeta de microlitro de un solo canal con una punta de polipropileno desechable de 10 μL. Permita que las gotitas se hundan en las monocapas lipídicas formadas en las interfaces hidrogel-aceite durante aproximadamente 5 minutos para formar una bicapa lipídica (Figura 3) entre las gotitas y el hidrogel de agarosa. Monte la cámara de PMMA con membranas DIB en el portamuestras de un microscopio de luz invertida y evalúe la formación de la membrana utilizando un objetivo de contraste de modulación Hoffman 10x (Figura 2, paso 6). La formación de membrana DIB está indicada por un anillo blanco transparente en la interfaz entre la gota y el hidrogel (Figura 4A). Las membranas DIB que se han roto no muestran este anillo (Figura 4B).NOTA: Alternativamente, las membranas DIB se pueden visualizar con un aumento de 10x mediante contraste de fase o microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC). Si se han formado membranas DIB, monte la cámara de PMMA en el portamuestras de un microscopio TIRF (Figura 2, paso 7) equipado con una fuente de luz convencional para iluminación de epifluorescencia, un láser de 488 nm (Pmax = 100 mW) y una cámara CCD multiplicadora de electrones retroiluminada (512 x 512 píxeles; >95% QE) para lograr un tamaño de píxel de ~0.16 μm. Enfoque el borde de una membrana DIB con un objetivo de aumento de 10x bajo iluminación de epifluorescencia con una fuente de luz de alta intensidad utilizando un conjunto de filtros GFP. Enfoque fino del mismo borde de la membrana DIB a gran aumento con un objetivo TIRF de aceite apocromático 100x/N.A. 1.49, nuevamente bajo iluminación de epifluorescencia, con la fuente de luz de alta intensidad utilizando un conjunto de filtros GFP que permite visualizar la fluorescencia de fondo débil del colorante fluorescente Fluo-8 en la gota (Figura 4C). Cambie la configuración del filtro de GFP al conjunto de filtros TIRF de cuatro bandas. Encienda el láser de 488 nm y ajuste la intensidad del láser en la lente del objetivo a un valor entre 8 mW y 10 mW.NOTA: Dado que a menudo no hay información cuantitativa sobre la intensidad del láser en la lente del objetivo, los ajustes de intensidad del láser deben calibrarse de antemano en mediciones separadas en la lente, con un medidor de potencia láser óptico equipado con un sensor de fotodiodo, de acuerdo con las especificaciones del fabricante.PRECAUCIÓN: Para garantizar el funcionamiento seguro del láser, el operador debe ser consciente de los posibles peligros de la radiación láser y las normas de prevención de accidentes. Para visualizar canales iónicos individuales, ajuste el ángulo TIRF y la ganancia de la cámara EMCCD (por ejemplo, ajuste del multiplicador de ganancia EM: 285) de modo que los canales iónicos abiertos en la membrana DIB aparezcan como puntos fluorescentes de alto contraste sobre un fondo oscuro (Figura 4D-G), y la relación señal-fondo, cuando se inspecciona visualmente, alcance un máximo. Asegúrese de que las manchas, correspondientes al flujo de Ca2+ a través de canales iónicos individuales, permanezcan enfocadas y tengan una forma redonda, con alta intensidad en el centro y disminuyendo gradualmente hacia la periferia. Las membranas sin canales muestran sólo fluorescencia de fondo (Figura 4C). Antes de registrar el movimiento y la actividad abierta-cerrada de los canales individuales a lo largo del tiempo, compruebe que los puntos fluorescentes están enfocados, para asegurarse de que los canales iónicos se han reconstituido en las membranas DIB y se mueven lateralmente en el plano de la membrana. Si este no es el caso, podría indicar que una molécula fluorescente está entrando y saliendo del campo evanescente generado por el láser cerca de la membrana. Grabe una serie de imágenes de membrana que permitan el seguimiento adecuado de la posición y el monitoreo del estado abierto-cerrado de los canales iónicos individuales. Para determinar el tipo de movilidad lateral (p. ej., movimiento libre vs anclaje transitorio [para referencia, véase16]) y el estado de actividad del canal (p. ej., abierto o cerrado), adquiera trayectorias suficientemente largas (p. ej., 30 s a 1 min) y bien muestreadas (p. ej., velocidad de fotogramas de 48 s-1).NOTA: La observación de la difusión canalizada, restringida o de salto16 requiere que la frecuencia de muestreo sea lo suficientemente rápida como para medir la difusión no restringida dentro de los límites de los límites. Además, asegúrese de que el tiempo de muestreo de datos sea lo suficientemente largo como para medir la transición de la difusión sin restricciones a la difusión restringida (para más detalles, véase Jacobson et al.16). Tratamiento de imágenes y datosNOTA: Los paquetes de procesamiento de imágenes de código abierto33 o las rutinas autoescritas17 basadas en paquetes de software comercial se pueden utilizar para analizar la dinámica espaciotemporal de canales iónicos individuales en DIB. Para poder correlacionar la movilidad lateral de la membrana con el flujo iónico a través de los canales individuales, no se deben aplicar algoritmos de filtro.Corregir series temporales de imagen para el blanqueo aplicando procedimientos estándar34 utilizando rutinas escritas por él mismo, ajustando la intensidad media del fotograma de la imagen completa a , donde t es el índice de fotogramas (tiempo) y a k son los parámetros de ajuste. A continuación, corrija la serie temporal según , donde I(t) es la intensidad. Alternativamente, para los análisis de datos iniciales, realice correcciones de fondo utilizando software de código abierto con algoritmos de bola rodanteimplementados 33 y un radio de bola rodante, dependiendo del tamaño de punto y píxel de la cámara (por ejemplo, 50 píxeles). Determine las posiciones espaciales y amplitudes de un punto de fluorescencia dentro de una región de interés definida (ROI) (por ejemplo, 30 x 30 píxeles), ajustando I(t) en un momento dado t a una función gaussiana bidimensional con inclinación plana que tenga en cuenta posibles gradientes de iluminación local de acuerdo con . Aquí, x = (x, y) es el ROI con la información de intensidad de fluorescencia, A y σ son la amplitud y anchuras del gaussiano, pk son parámetros que caracterizan la intensidad de fondo del ROI, y μ = (x 0, y0) define la posición del gaussiano. El flujo de iones a través de un canal individual viene dado por el parámetro A. La trayectoria del canal viene dada por x, y permite determinar la movilidad lateral del canal. Alternativamente, es posible determinar las posiciones e intensidades de los puntos individuales utilizando plataformas de código abierto33 y plug-ins como se describe35,36. Estimar la precisión posicional37 después de la conversión de la lectura de la cámara EMCCD en números de fotones38. Trazar la amplitud de fluorescencia A frente al tiempo y la trayectoria correspondiente x para determinar una posible correlación entre la difusividad del canal y el flujo de iones a través del canal. Realice esto con cualquier software de gráficos. En caso de movimiento del canal lateral libre, determinar el coeficiente de difusión lateral D mediante regresión lineal del retardo de tiempo τ, y calcular el desplazamiento cuadrático medio de las manchas desde x de acuerdo con .NOTA: Los coeficientes de difusión típicos17 para TOM-CC y OmpF que se mueven libremente en membranas DIB oscilan entre 0,5 y 1,5 μm2 s-1. Las moléculas cuya constante de difusión es inferior a 0,01 mm2·s-1 se definen como inmovilizadas17.