全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いた脂質二重膜の横方向移動度とイオンチャネル活性の1分子イメージング(英語)

1.タンパク質生産 注:このセクションでは、LamBとOmpCを欠く大腸菌BE BL21(DE3)omp631,32からOmpFを分離する手順と、ニューロスポラクラッサからTOMコア複合体を分離する手順について説明します(図1)28,29。後者は、TOMサブユニットTom22の6xHis標識形態を含むN.クラッサ株28から単離されたミトコンドリアを必要とし(図1A)、これは28に記載のように単離することができる。以下のプロトコルは、通常、1〜2 mgのN.クラッサTOM-CCおよび10 mgの大腸菌OmpFを生成します。量を調整する場合は、タンパク質/界面活性剤の比率を正確に維持することが重要です。特に指定のない限り、すべてのステップは4°Cで実行する必要があります。 TOMコア複合体の単離Bauseweinら30によると、約1.5 kg(湿重量)菌糸からの差動沈降によって得られた精製 N.クラッサ ミトコンドリア(2 gのタンパク質)を、20 mM Tris-HCl(pH 8.5)、1%(w/v)DDM、20%(v/v)グリセロール、300 mM NaCl、20 mMイミダゾール、および1 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)中のタンパク質濃度10 mg/mLで4°Cで30分間可溶化します。注意:PMSFは有毒です。適切な個人用保護具を着用してください。 可溶化ミトコンドリアを超遠心管に移し、130,000 x g で4°Cで40分間超遠心し、標準グレードのろ紙でろ過することにより、可溶化膜タンパク質から非可溶化膜を分離します。 自動タンパク質精製システムを使用して、充填済みのNi-NTAカラム(容量5 mL)を約5カラム容量(CV)のバッファーA1(表1)で平衡化します。Ni-NTAカラムは、すべてのステップで1 mL/minの一定流量で稼働させます。タンパク質が2 g未満のミトコンドリアから単離されている場合は、低容量カラム(1 mL)を使用してください。 可溶化タンパク質サンプルを Ni-NTA カラムに 1 mL/分の流速でロードします。 Ni-NTAカラムを5 CVのバッファーA1(表1)で洗浄し、結合していないタンパク質を除去します。 Hisタグ付きTOM-CCを30%バッファーA2で溶出し(表1;300 mMイミダゾール)、280 nmクロマトグラムに現れるタンパク質ピークを収集します(図1B)。 TOM-CCをさらに精製するには、自動タンパク質精製システムを使用して、充填済みの陰イオン交換カラム(1 mL)をバッファーB1、B2、およびB1(表1)のそれぞれ5 CVで平衡化します。陰イオン交換カラムは、すべてのステップで1 mL/minの一定流量で運転します。 TOM-CCピーク画分(ステップ1.1.6)を陰イオン交換カラム(流速1 mL/分)にロードします。 5 CVのバッファーB1(表1)および0%〜20%バッファーB2の線形塩勾配(表1)でカラムを洗浄することにより、未結合タンパク質を除去します。 20%-35%バッファーB2の線形塩勾配でTOM-CCを溶出し、280 nmクロマトグラムに現れるタンパク質ピーク画分を収集します(図1C)。 SDS-PAGE(図1D)でサンプルの純度を評価し、メーカーのプロトコルに従って市販のタンパク質アッセイを使用してタンパク質濃度を決定します( 材料表を参照)。 タンパク質サンプルを液体窒素で凍結し、さらに使用するまで-80°Cで保存します。注意: 液体窒素は換気の良い場所で取り扱う必要があります。適切な個人用保護具を着用してください。   OmpFの分離LamBおよびOmpC32を欠く大腸菌株BE BL21(DE3) omp6を、無菌条件下で凍結グリセロールストックから回収し、Luria-Bertani(LB)寒天プレートにストリークします(表2)。これを行うには、サンプルをプレート全体に均等に徐々に広げます。 サンプルを寒天に5分間浸した後、蓋を閉めた状態でプレートを反転させ、37°Cで一晩インキュベートします。 単一の 大腸菌 コロニーを選択し、滅菌爪楊枝を使用してこの単一コロニーに7.5 mLのLB培地(表2)を接種し、37°Cで攪拌(170 rpm)しながら一晩(14時間)増殖させます。 滅菌ピペットで2 x 1 mLの 大腸菌 細胞を2 x 500 mLのLB培地に移し(表2)、振とう機で攪拌(~170 rpm)しながら37°Cで一晩(~14時間)増殖させます。 5,000 x g で4°Cで20分間遠心分離して細胞を回収し、ペレットを液体窒素で凍結し、さらに使用するまで-80°Cで保存します。注:細胞ペレットの湿重量は、通常、培養液1 Lあたり5 gです。この時点で、プロトコルを一時停止できます。 細胞(2 g)を20 mLの溶解バッファーC1(表2)に解凍して再懸濁し、製造元の指示に従って、懸濁液を予冷(4°C)高圧細胞破壊システムに1,000 psiで3回通します。注意: フレンチプレスを使用すると、重傷を負う可能性があります。使用するセルの圧力制限を超えないようにしてください。適切な個人用保護具を着用してください。 4,000 x g で15分間遠心分離することにより、ライセートから壊れていない細胞を取り除き、上清を回収します。 100,000 x g で1時間の超遠心分離によって膜を収集します。 メンブレンペレットを10 mLのバッファーC2(表2)に再懸濁し、ボールベアリングガラスホモジナイザーを使用して等容量のSDSバッファーC3(表2)と混合します。注意:バッファーC3中のβ-メルカプトエタノールは有毒です。関連するすべての安全規制に従ってください。 懸濁液を50°Cの水浴中で30分間インキュベートします。 サンプルを100,000 x g で20°Cで1時間遠心分離します。 ボールベアリングガラスホモジナイザーを用いてメンブレンペレットを10mLのSDSバッファーC4(表2)に再懸濁し、懸濁液を37°Cの水浴中で30分間インキュベートします。注:ペレットを再懸濁できない場合は、SDSバッファーC4を20mLの容量まで追加します。 サンプルを100,000 x g で20°Cで30分間遠心分離し、上清を回収します。 上清をオクチルポリオキシエチレン(オクチルPOE)と最終洗剤濃度0.5%(w / v)まで混合し、サンプルをバッファーC5(表2)に対して4°Cで24時間透析します。この目的のために、製造元の指示に従って、20 kDaのカットオフの透析チューブを使用し、サンプルを透析チューブまたはデバイスに入れます。注:他の分子量のタンパク質を透析する場合は、透析チューブの切断を調整する必要があります。 SDS-PAGEでサンプルの純度を評価し、メーカーのプロトコル(材料表)に従って、市販のタンパク質アッセイを使用してタンパク質濃度を決定します。注:95°Cに加熱されたサンプルは単量体OmpFを示します。加熱されていないサンプルは、三量体形態のOmpFを示しています(図1F)。 ショックフリーズ透析OmpFを液体窒素中のアリコートで行い、さらに使用するまで-20°Cで保存します。注意: 液体窒素は換気の良い場所で取り扱う必要があります。適切な個人用保護具を着用してください。 2. DIB膜中のイオンチャネルの光シングルチャンネル記録 注:このセクションでは、微細加工ポリメチルメタクリレート(PMMA)チャンバー2 でDIBメンブレンを調製して、単一イオンチャネル17を通る横方向のタンパク質移動とイオンフラックスを監視する手順について説明します。チャンバーを製造するための寸法および正確な図面は、Lepthinら2に見出すことができる。 図2 は、PMMAチャンバー2 の組み立てとDIB膜の形成の概要を示しています。特に断らない限り、全ての工程は室温(RT)で行われる。図3は、DIBメンブレンの概略 図 と、単一チャネルタンパク質を通るCa2+ フラックスを使用して、メンブレン内の動きとチャネルの開閉状態の両方を監視する方法を示しています。 脂質の調製クロロホルムに溶解した1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(25 mg/mL DPhPC)を含む脂質ストック溶液を-20°Cの冷凍庫から取り出し、室温まで昇温した。この目的のためには、一般に、サンプルを手で数分間ゆっくりと温めるだけで十分です。注意: クロロホルムは有毒です。適切な個人用保護具を着用し、ドラフトの下でクロロホルムを含むすべての手順を実行してください。 380 μLのDPhPCストック溶液(25 mg/mL DPhPC)をガラスバイアルに移します。ゴム製のシーリングが付いたピペットは避けてください。代わりに、ステンレス鋼のプランジャーを備えたマイクロリットルのガラスシリンジを使用してください。 脂質原液を取り扱いた後、脂質原液をArまたはN2 ガスで重ねて脂質酸化を防止する。脂質が溶解している有機溶媒の蒸発やバイアルからの溶媒スプレーの飛散を避けるために、可能な限り低いガス流量を使用してください。有機溶媒を含む脂質を含むガラスバイアルの蓋の内側がポリテトラフルオロエチレン(PTFE)でコーティングされていることを確認してください。 脂質サンプルをN2の流れ下で乾燥させ(ステップ2.1.2)、オイルフリー真空ポンプを使用して真空下(2.0mbar)で一晩脂質サンプルから残りの有機溶媒を除去します。 マイクロリットルガラスシリンジを使用して等量のヘキサデカンとシリコーンオイル(各500 μL)を加えて、脂質フィルムをヘキサデカン/シリコーンオイル溶液に溶解し、最終脂質濃度9.5 mg/mLにします。注:脂質溶液はRTで数週間安定です。 アガロースヒドロゲルの調製二重脱イオン水中の低融点アガロース溶液(0.75%[w/v])約1 mLを調製し、ガラスカバーガラスのスピンコーティングに使用する加熱ブロックで85°Cに20分間加熱します。注:アガロース溶液はRTで数週間保持でき、数回再加熱できます。 0.66 M CaCl 2および8.8 mM HEPES(pH 7.2)中の低融点2.5 %(w/v)アガロース溶液を調製し、加熱ブロックで85°Cに20分間加熱します。アガロースがよく溶けていることを確認してください。注:アガロース溶液はRTで数週間保持でき、スピンコーティングに使用されるアガロース(ステップ2.2.1)と同様に数回再加熱できます。 ヒドロゲルヘキサデカン/シリコーンオイル界面におけるポリメチルメタクリレート(PMMA)チャンバーアセンブリと脂質単分子膜形成ガラスカバースリップ(40 mm x 24 mm x 0.13 mm)をステンレス鋼のカバースリップホルダーに入れ、超音波洗浄機のアセトンでガラスビーカーで10分間洗浄します。カバーガラスを沈めるのに十分なアセトンを使用し、ビーカーをガラス板でゆるく覆い、洗浄プロセス中の蒸気の漏れを最小限に抑える無圧の閉鎖システムを作成します。注意: アセトンは引火点の低い可燃性の高い溶剤です。蒸気/空気混合物は爆発性です。換気の良い場所で超音波洗浄機を操作してください。適切な個人用保護具を着用し、公式の安全上の注意(裸火や火花がないなど)を遵守してください。 ガラスカバーガラスを二重脱イオン水ですすぎ、N2の流れの下で乾燥させます。注意: この方法で洗浄されたカバーガラスは、数週間保管できます。 カバーガラスをさらに洗浄し、プラズマクリーナーで酸素(0.5 mbar)で5分間親水化します。注:プラズマ洗浄の親水性効果は時間の経過とともに低下するため、アガロース溶液でスピンコーティングする直前にこのステップを実行してください。 プラズマ処理したカバーガラスをスピンコーターに取り付けます(図2、ステップ1)。 200 μLのピペットを使用して、140 μLの加熱した0.75%(w/v)低融点アガロース(ステップ2.2.1)を3,000 rpmで30秒間ゆっくりと添加することにより、カバーガラスをサブマイクロメートルの厚さのアガロースフィルムでコーティングします(図2、ステップ1)。注:アガロースフィルムの厚さは、17で説明されているように、原子間力顕微鏡(AFM)によって決定できます。 アガロースヒドロゲルの薄層を有するスピンコートカバーガラスを直ちにPMMAチャンバー2の下側に取り付ける。アガロースヒドロゲルが上を向いていることを確認します(図2、ステップ2)。 カバーガラスの端を透明な粘着テープでPMMAマイクロマシニングデバイスに固定します。 PMMAデバイスを35°Cに加熱したホットプレートに置きます(図2、ステップ3)。 200 μLの2.5%アガロース溶液(ステップ2.2.2)をピペットでチャンバーの入口に注意深く注ぎ(図2、ステップ3)、スピンコーティングによって塗布された薄いヒドロゲルが2.5%アガロース溶液のバッファーと平衡化し、水和したままになるようにします。2.5%アガロース溶液がスピンコーティングされたアガロースヒドロゲルの周囲に広がっていることを確認し、PMMAチャンバーを加熱プレートに軽く押し付けることで回避できます(図3A)。 直ちにPMMAチャンバーのウェル(図2、ステップ4)を合計60 μLの脂質/オイル溶液で覆い(ステップ2.1.5)、アガロース-オイル界面で脂質単層の形成を開始し、PMMAチャンバーのウェル内のスピンコーティングアガロースの脱水を回避します。デバイスを35°Cのホットプレートに約2時間保持します。注:以前に発表された研究2によると、PMMAチャンバー内の円形ウェルの直径は0.5 mm、深さは1.8 mmです。 ヘキサデカン/シリコーンオイル溶液中の脂質被覆水性液滴の調製20 μLの脂質ヘキサデカン/シリコーンオイル溶液(ステップ2.1.5)を、液滴インキュベーションチャンバー内のいくつかの微細加工ウェルのそれぞれに入れます(図2、ステップ4)。脂質ヘキサデカン/シリコーンオイル溶液に適した容器は、薄いPMMAプレート2の40mm x 30mm x 3.5mmの小さなくぼみです。 垂直または水平のマイクロピペットプーラー(パッチピペットや鋭利なガラス電極の製造に使用)を使用して、先端開口部直径20μmのマイクロキャピラリーガラスニードルを準備します。7.5倍から35倍のズーム範囲で、低倍率で双眼実体顕微鏡下でマイクロキャピラリーガラス針の開口部直径を推定します。注意: ガラスキャピラリーを引っ張る前の予熱モードの設定、引っ張るための加熱モード、および牽引力は、引っ張り装置のメーカーの仕様とキャピラリーのタイプに応じて、事前に実験的に決定する必要があります。 マイクロキャピラリーガラスニードルに、8.8 mM HEPES(pH 7.2)、7 μM Fluo-8、400 μM EDTA、1.32 M KCl、および30 nM TOMコアコンプレックスを含む5 μLの水性注入液、またはマイクロキャピラリーピペットチップを使用して20 nM OmpFを充填します。多価金属イオン(Ca2+)と結合するキレート樹脂で予め処理した二重蒸留水のみを使用して水性注入液を調製する。 マイクロキャピラリーガラスニードルを水性注入液とともにピエゾ駆動のナノインジェクターに取り付けます。 ナノインジェクターを使用して、8.8 mM HEPES(pH 7.2)、7 μM Fluo-8、400 μM EDTA、1.32 M KCl、および30 nM TOMコアコンプレックス(ステップ1.1.12)、または20 nM OmpF(ステップ1.2.16)を含む100〜200 nLの水性液滴(図2、ステップ4)を、脂質ヘキサデカン/シリコーンオイル溶液(2.1.5を参照)で満たされた液滴インキュベーションチャンバー内のウェルに注入します。液滴を数ミリメートル(>10 mm)離してウェルに入れて、液滴が互いに接触しないようにしてください。それ以外の場合、脂質単層がオイル/バッファー界面でまだ形成されていない場合、それらはより大きな液滴に融合します。注:クラスキャピラリーとナノインジェクターが利用できない場合は、2の説明に従って、0.1 μL〜0.5 μLの容量のシングルチャンネルマイクロリットルピペットを使用して液滴を手動で調製することもできます。ただし、この場合、液滴量はそれほど正確ではありません。 35°Cに加熱したホットプレート上でPMMAおよび液滴インキュベーションチャンバー(図2、ステップ4)を維持することにより、液滴/油界面に脂質単層を約2時間形成できます。 DIB膜における単一イオンチャネルの調製とイメージング10 μLの使い捨てポリプロピレンチップを備えたシングルチャンネルマイクロリットルピペットを使用して、実体顕微鏡下で液滴インキュベーションチャンバーのウェルからPMMAチャンバーのウェルに個々の水性液滴を手動で移します(図2、ステップ5)。液滴をヒドロゲル-油界面に形成された脂質単層上に約5分間沈め、液滴とアガロースヒドロゲルの間に脂質二重層(図3)を形成します。 DIBメンブレンを備えたPMMAチャンバーを倒立光学顕微鏡のサンプルホルダーに取り付け、10倍ホフマン変調コントラスト対物レンズを使用してメンブレン形成を評価します(図2、ステップ6)。DIB膜形成は、液滴とヒドロゲルとの間の界面における透明な白色リングによって示される(図4A)。壊れたDIBメンブレンには、このリングは表示されません(図4B)。注:あるいは、DIB膜は、位相差または微分干渉コントラスト(DIC)顕微鏡によって10倍の倍率で視覚化することができます。 DIB膜が形成されている場合は、PMMAチャンバーを、従来の落射蛍光照明用光源、488 nmレーザー(Pmax = 100 mW)、および裏面照射型電子増倍CCDカメラ(512 x 512ピクセル、>95%QE)を備えたTIRF顕微鏡(図2、ステップ7)のサンプルホルダーに取り付けて、~0.16 μmのピクセルサイズを実現します。 GFPフィルターセットを使用して、高輝度光源による落射蛍光照明下で、10倍の倍率対物レンズでDIB膜の端に焦点を合わせます。 液滴中の蛍光色素Fluo-8の弱いバックグラウンド蛍光を可視化できるGFPフィルターセットを使用して、100倍/N.A. 1.49アポクロマートオイルTIRF対物レンズを使用して、DIB膜の同じエッジを高倍率でファインフォーカスします(図4C)。 フィルタ設定をGFPからクワッドバンドTIRFフィルタセットに変更します。 488 nmレーザーのスイッチを入れ、対物レンズのレーザーの強度を8 mW〜10 mWの値に設定します。注:対物レンズでのレーザー強度に関する定量的な情報がないことが多いため、レーザー強度設定は、メーカーの仕様に従って、フォトダイオードセンサーを備えた光レーザーパワーメーターを使用して、レンズでの個別の測定で事前に校正する必要があります。注意: レーザーの安全な操作を確実にするために、オペレーターはレーザー放射の潜在的な危険性と事故防止規則に注意する必要があります。 単一イオンチャネルを可視化するには、TIRF角度とEMCCDカメラゲインを調整し(EMゲイン乗数設定:285など)、DIBメンブレンの開いたイオンチャネルが暗い背景に高コントラストの蛍光スポットとして表示され(図4D-G)、目視検査時にS/G比が最大になるようにします。単一イオンチャネルを通るCa2+フラックスに対応するスポットが焦点を合わせたままで丸い形をしており、中央が高強度で、周辺に向かって徐々に減少することを確認します。チャネルのないメンブレンはバックグラウンド蛍光のみを示します(図4C)。 個々のチャネルの動きと開閉活動の経時を記録する前に、蛍光スポットに焦点が合っていることを確認し、イオンチャネルがDIB膜に再構成され、膜面内で横方向に移動していることを確認します。そうでない場合は、蛍光分子が膜近くのレーザーによって生成されたエバネッセント場に出入りしていることを示している可能性があります。 位置の適切な追跡と個々のイオンチャネルの開閉状態のモニタリングを可能にする一連の膜画像を記録します。横方向の移動度の種類(例えば、自由運動対過渡的な停泊地[参考のために、16を参照])およびチャネル活動の状態(例えば、開いたか閉じているか)を決定するには、十分に長い(例えば、30秒から1分)そして十分にサンプリングされた軌道(例えば、48 s-1のフレームレート)を取得する。注:チャネリング拡散、制限拡散、またはホップ拡散16 の観測には、サンプリングレートが限られた境界内の無制限の拡散を測定するのに十分な速さが必要です。さらに、データのサンプリング時間が、制約なし拡散から制約拡散への遷移を測定するのに十分長いことを確認してください(詳細については、Jacobsonら16を参照)。 画像およびデータ処理注:市販のソフトウェアパッケージに基づくオープンソースの画像処理パッケージ33 または自作ルーチン17 を使用して、DIB内の個々のイオンチャネルの時空間ダイナミクスを解析することができる。横方向の膜移動度を個々のチャネルを通るイオンフラックスと相関させるには、フィルターアルゴリズムを適用しないでください。漂白のための正しい画像時系列は、自己書き込みルーチンを用いて標準手順34を適用し、フル画像の平均フレーム強度をフィッティングすることによって、ここでtはフレームインデックス(時間)であり、kはフィッティングパラメータである。次に、に従って時系列を修正します ここで、I(t)は強度です。あるいは、初期データ分析のために、カメラのスポットおよびピクセルサイズ(例えば、50ピクセル)に応じて、実装されたローリングボールアルゴリズム33およびローリングボール半径を有するオープンソースソフトウェアを使用してバックグラウンド補正を実行する。 所定の時間tにおけるI(t)を、に従って可能な局所照明勾配を説明する平面傾斜を有する2次元ガウス関数にフィッティングすることにより、定義された関心領域(ROI)(例えば、30 x 30ピクセル)内の蛍光スポットの空間位置および振幅を決定する。ここで、x=(x,y)は蛍光強度情報によるROIであり、Aおよびσはガウスの振幅および幅であり、pkはROIのバックグラウンド強度を特徴付けるパラメータであり、μ=(x0,y0)はガウス分布の位置を定義する。 個々のチャネルを通るイオンフラックスは、パラメータAによって与えられる。チャネルの軌道はxで与えられ、チャネルの横方向の移動度を決定することができます。あるいは、35、36に記載されるようなオープンソースプラットフォーム33およびプラグインを使用して個々のスポットの位置および強度を決定することができる。EMCCDカメラ読み出しを光子数38に変換した後の位置精度37を推定する。 時間に対する蛍光振幅Aおよび対応する軌跡xをプロットして、チャネル拡散率とチャネルを通るイオンフラックスとの間の可能な相関を決定する。これは、任意のグラフィックソフトウェアで実行します。自由横流路移動の場合、時間遅延τの線形回帰により横方向拡散係数Dを求め、xからスポットの平均二乗変位を算出する。注:DIBメンブレン内を自由に移動するTOM-CCおよびOmpFの典型的な拡散係数17は、0.5〜1.5μm2 s-1の範囲です。拡散定数が0.01mm2・s-1未満の分子は固定化17と定義される。