Standardizzazione del trasferimento tra laboratori tra citometri a flusso per il rilevamento di linfociti in bambini vaccinati contro l'encefalite giapponese

La standardizzazione della citometria a flusso è utile per la comparabilità dei risultati ottenuti da diversi citometri tra diversi laboratori e centri di studio e favorisce il riconoscimento reciproco dei risultati per migliorare l’efficienza del lavoro. Un numero crescente di scenari richiede una standardizzazione. Durante il processo di sviluppo del farmaco, la standardizzazione della citometria a flusso è importante, poiché un test sviluppato e convalidato supporterà l’intero processo di sviluppo del farmaco dall’analisi preclinica a quella clinica. I metodi citometrici a flusso sono spesso trasferiti tra l’industria farmaceutica e i laboratori che collaborano¹. Inoltre, è essenziale ottenere dati comparabili da studi clinici multicentrici. Ad esempio, è stato sviluppato un flusso di lavoro di standardizzazione nel progetto di ricerca clinica multicentrica sulle malattie autoimmuni sistemiche per ottenere dati comparabili dalla citometria a flusso multicentrica².

La standardizzazione dei metodi di citometria a flusso è impegnativa. Le sfide incontrate nei laboratori sono attribuite alla mancanza di materiali standardizzati, problemi di compatibilità software, incongruenze nella configurazione degli strumenti e l’uso di diverse configurazioni tra diversi citometri a flusso e strategie di gating divergenti tra i centri ^3,4. Pertanto, è importante condurre un’analisi del divario tra i laboratori. L’accesso ai campioni, i sistemi di qualità, le qualifiche del personale e la configurazione degli strumenti devono essere rivisti per garantire che i requisiti siano soddisfatti.

Attualmente, i bambini vaccinati con il vaccino contro l’encefalite giapponese (JE) hanno un’incidenza significativamente ridotta di JE⁵. Il monitoraggio delle cellule immunitarie del sangue periferico può aiutare a comprendere i cambiamenti nell’immunità adattativa cellulo-mediata dopo la vaccinazione e la correlazione tra i cambiamenti nei sottogruppi di linfociti del sangue periferico e gli effetti della vaccinazione. A causa della limitata stabilità dei campioni di sangue intero, le valutazioni dell’efficacia del vaccino vengono spesso eseguite in più centri. Per questa analisi, abbiamo definito le cellule T CD8+ o CD4+ naïve come CD27+ CD45RA+, le cellule T della memoria centrale (T_CM) come CD27+ CD45RA^, le cellule T della memoria effettrice (T_EM) come CD27-CD45RA^– e le cellule T della memoria effettrice terminalmente differenziata (T_EMRA) come CD27-CD45RA⁺. Le cellule B CD19⁺ possono essere separate in popolazioni che esprimono CD27 rispetto a IgD ^6,7, le cellule B naïve esprimono le cellule B di memoria CD27n (mBC) possono essere identificate in base all’espressione di IgD⁶ e le cellule T regolatorie (Treg) possono essere identificate come CD4⁺CD25⁺⁺CD127^{basso 8}. Per stabilire un esperimento standardizzato di citometria a flusso per ottenere la coerenza e la comparabilità dei risultati sperimentali in più centri, è stato stabilito un metodo di standardizzazione rapido e fattibile per facilitare il trasferimento di protocolli attraverso diversi citometri a flusso per la rilevazione di linfociti nel sangue intero di bambini vaccinati con JE. Sei bambini sani (2 anni) sono stati reclutati dall’ospedale pediatrico di Pechino, Capital Medical University. Dopo aver ricevuto una vaccinazione primaria e boost con un vaccino JE SA14-14-2 vivo attenuato meno di 6 mesi prima, sono stati raccolti campioni di sangue periferico dai volontari. Dati altamente comparabili sono stati ottenuti da diversi strumenti seguendo procedure standardizzate, il che è utile per le valutazioni multicentriche.