使用短生物素化RNA对RNA结合蛋白进行优化的定量下拉分析

1. 一般方法和材料 为所选的哺乳动物细胞培养物准备适当的培养基，并在使用前将其在37°C下预热20分钟。 按照材料表中所述提前准备所需 材料。高压灭菌玻璃器皿、塑料器皿和缓冲库存。 如 表1所述准备缓冲液。在将组分稀释至最终体积之前，使用浓HCl或NaOH调节储备溶液的pH值。 2. 哺乳动物细胞系制备 在 Dulbecco 的改良鹰培养基 （DMEM） 中培养 HEK 293T 细胞，并补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 和 100 μg/mL 青霉素/链霉素溶液。将它们在37°C下在提供5%CO2的加湿培养箱中孵育。常规分裂细胞。 在分离之前，用足够的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液冲洗细胞以覆盖生长表面。 取出PBS并加入超薄的胰蛋白酶-EDTA溶液。 将细胞在37°C下在提供5%CO2 的加湿培养箱中孵育5分钟，或直到细胞分离（它们在显微镜观察下应看起来分散）。 通过添加完整的DMEM将其稀释十倍以使其失活并计数细胞。 在 6 孔板中板 1.5 x 105 个细胞/mL，考虑两个孔/条件进行测试。 将细胞在37°C下在含有5%CO2的加湿培养箱中孵育48小时。注意：查看制造商说明，了解适合细胞系的培养基和补充剂类型。此外，胰蛋白酶-EDTA的量和孵育时间取决于细胞系。一些细胞类型的生长速度比本协议中报告的更快/更慢;因此，应事先测试播种浓度。 3. 总蛋白质收获 从细胞生长的孔中取出培养基。 用 1 mL PBS 洗涤 6 孔板的每个孔。 丢弃 PBS。 将板在冰上移动，然后继续步骤3.5或在-80°C下冷冻干燥板以促进裂解。 向每个孔中加入 200 μL 裂解缓冲液。 使用细胞刮刀分离和破坏细胞。 将来自两个孔的细胞提取物转移到同一个 1.5 mL 管中。 将含有蛋白质提取物的试管放在冰上30分钟。 在4°C下以17，000× g 离心细胞裂解物15分钟。 将每个上清液转移到预冷管中。注意：对于每个PD条件，建议总共106-10 7 个细胞。细胞裂解和蛋白质收获应使用冰冷缓冲液进行。应将蛋白酶抑制剂添加到裂解缓冲液中，以防止蛋白质降解。 4. 蛋白质浓度测定 按照生产者的指示，通过在dH2O中稀释五倍来制备Bradford试剂。 将 1 mL 试剂分布在 1 cm 比色皿中，加入 1 μL 样品，倒置混合。 在室温下在黑暗中孵育5-10分钟。 读取595nm处的吸光度。 计算对应于 1.5 mg 蛋白质的蛋白质提取物体积，并使用裂解缓冲液将所有样品的最终体积降至 600 μL。 将样品放在冰上直至使用。注意：可以使用任何其他蛋白质浓度测定方法，遵循缓冲液兼容性建议。在任何情况下，裂解缓冲液都应用作空白。许多试剂与二硫苏糖醇（DTT）不相容。建议仅在蛋白质定量后添加DTT或其他还原剂（DTT至终浓度为1mM）。 5. 珠子制备 通过轻弹试管将珠子混合在其存储缓冲液中。 计算 100 μL 浆液培养基/样品，并将体积放入磁性架中。 珠子清洗取出储存溶液，通过加入 1 mL 裂解缓冲液/管洗涤珠子并手动倒置。 使用磁性架取出缓冲液。 重复洗涤步骤。 加入相当于浆液介质初始体积的裂解缓冲液体积，轻弹试管进行混合，并将培养基均匀分配到与样品数量一样多的 1.5 mL 管中。 磁珠阻塞使用磁性架取出缓冲液，加入 600 μL 在裂解缓冲液中制备的 0.25 mg/mL 酵母 tRNA 溶液。 在室温下在旋转轮上孵育1小时。 使用磁性架去除tRNA溶液。 加入 600 μL 裂解缓冲液，手动混合洗涤。 重复洗涤步骤并丢弃缓冲液。 6. 装珠 在 600 μL 裂解缓冲液中为含有初始 100 μL 浆液培养基（现在封闭的磁珠）的每个试管制备 200 μg RNA 寡核苷酸。 将寡核苷酸加入珠子中，在室温下旋转孵育1小时。 取出溶液，加入 600 μL 裂解缓冲液，并在室温下旋转试管 5 分钟，洗涤珠子两次。 丢弃缓冲区。注意：切勿涡旋珠子，而是轻弹。除非必要，否则限制移液步骤的数量。如果可能，请使用切好的 1 mL 吸头。磁珠浆液培养基/样品的量取决于磁珠的结合能力和总蛋白的起始量。如果预测RNA寡核苷酸具有大量的二级结构，我们建议首先在80°C下使其变性10分钟，然后在室温下缓慢冷却或通过在30°C下孵育1小时来重新冷却。建议在磁珠上样后回收RNA寡核苷酸并确定剩余浓度，以优化上样所需的量并评估重复使用RNA的可能性。 7. 蛋白与珠子的结合 注意：从现在开始，如果可能，请在4°C下执行这些步骤。 从 600 μL 蛋白质溶液中取出 5% 的体积，并将其保留为 INPUT （IN） 以供进一步分析（将 1.5 mg 蛋白质溶解在 600 μL 中，因此 5% 对应于 30 μL 和 75 μg 蛋白质）。 将剩余的蛋白质混合物添加到每管装载的珠子中，并在4°C下缓慢旋转过夜。 8. 非特异性粘合剂的洗涤 使用磁性架取出未绑定的部分。保存 5% 的体积并将其标记为 FLOWTHROUGH （FT）（未结合的体积约为 600 μL，因此再次保留 30 μL 以供进一步分析）。 向珠子中加入1mL洗涤缓冲液1，并在4°C下旋转5分钟。 丢弃缓冲区。 重复步骤 8.2 和 8.3。 向珠子中加入1mL洗涤缓冲液2，并在4°C下旋转5分钟。 弃去上清液。 9. 特定粘合剂的洗脱 向磁珠中加入 100 μL 洗脱缓冲液 1 或洗脱缓冲液 2。 通过轻弹手动混合并在室温下孵育5分钟。 将试管放入热混合器中，在95°C下剧烈摇动5分钟。 将试管放入磁性架中，并将洗脱的馏分收集到干净的管中。 使用台式离心机快速旋转珠子，以最大限度地提高洗脱液的回收率。 保存洗脱液（EL）总体积的5%用于进一步分析（总体积为100 μL，因此将5 μL分离到另一个管中）。 如果需要，可以使用洗脱缓冲液作为空白液来确定蛋白质浓度，如第4节所示。注意：在确定蛋白质浓度之前，建议不要向洗脱缓冲液中添加DTT。如果不需要蛋白质定量，或者如果有还原剂兼容的蛋白质定量试剂盒，则可以从一开始就向洗脱缓冲液中添加1 mM DTT。在该协议中，测试洗脱缓冲液1（含有1M NaCl）和洗脱缓冲液2（含2M NaCl）。随着离子强度的增加，目标蛋白的洗脱效率没有差异，但建议在建立最合适的缓冲液之前测试这两种条件。如果洗脱缓冲液中盐含量高是进一步分析的限制，则洗脱缓冲液中极少量的去垢剂允许缓冲液更换。作为替代方案，洗脱液可以稀释以达到所需的盐浓度。 10. 质谱鉴定蛋白质结合剂 丙酮沉淀通过在冷（-20°C）丙酮中稀释四倍来浓缩洗脱的蛋白质。 涡旋并将管在-20°C孵育过夜。 在4°C下以17，000× g 旋转30分钟。 轻轻除去上清液，让丙酮蒸发，直到沉淀完全干燥。 溶液内蛋白质消化通过加入 50 μL 变性缓冲液溶解蛋白质沉淀。 加入DTT至终浓度为5mM，允许蛋白质在55°C下还原30分钟。 在室温下冷却样品并进行蛋白质烷基化反应，加入浓度为10mM的碘乙酰胺（IAA）15分钟。 使用合适的酶（胰蛋白酶，LysC）消化蛋白质，并将样品在37°C孵育过夜。 通过添加 1 μL 10% 三氟乙酸 （TFA） 停止消化。 纯化肽并将其浓缩在定制的反相C18微柱上，如前所述19。 用缓冲液B从C18吸头洗脱肽。 使用真空离心机去除有机成分，并将肽重悬于5 μL 0.1%甲酸中以进行进一步分析。注意：或者，蛋白质消化可以在洗涤非特异性粘合剂后立即“在珠子上”进行（步骤8.1-8.6），从而使方案更快。然而，建议测试在溶液消化中与标准蛋白相比，在磁珠上起作用的酶的效率，以保证最佳的实验蛋白序列覆盖率。 液相色谱-串联质谱 （LC-MS/MS）插入分析柱（C18固定相）并在运行期间将其保持在45°C。 在单柱配置中，通过毛细管指紧接头（20 μm x 550 mm）将色谱柱连接到液相色谱泵六通旋转阀的出口。 按如下方式调整 LC 设置：在缓冲液A中以受控压力（980 bar）加载肽。 在59分钟内以300 nL / min的速度施加5%-20%缓冲液B梯度，然后在15分钟内施加20%-30%缓冲液B梯度，在5分钟内施加30%-65%缓冲液B梯度。 通过在5分钟内将缓冲液B的浓度增加至95%加上在95%缓冲液B下等度5分钟的步骤来添加洗涤步骤。 在数据依赖性采集 （DDA） 模式下操作质谱仪，在 MS 和 MSMS 事件之间自动切换。 对于MS和MSMS事件，使用自动增益控制（AGC）目标值分别为3 x 106 和1 x 105 定义等于15的环路计数。 对于分辨率为 60 K 的 MS，将允许的最大离子积累时间设置为 20 ms，对于分辨率为 15 K 的 MSMS，将允许的最大离子积累时间设置为 100 ms。 使用28%的归一化碰撞能量进行高碰撞解离（HCD）碎裂实验，动态排除时间为20 s。 源参数操作如下：喷雾电压：1.7 kV毛细管电压：275°C既不使用护套，也不使用辅助气体注意：在本协议中，超高效液相色谱（UHPLC）质谱（MS）分析专门使用LC单柱设置与混合三重四极杆轨道仪器（材料表）耦合。可以使用其他LCMS系统，但建议调整参数。 数据分析使用 “加载 ”按钮导入原始文件。 通过单击“设置实验”按钮定义 实验 名称。 进入组特定参数部分，指定与标识相关的所有参数：用于消化的酶：胰蛋白酶/P漏诊：最多三个固定修饰：氨基甲酰甲基化可变修饰：N-乙酰基（蛋白质），氧化（M） 上传更新的 FASTA 文件，该文件可从公共数据库（如 UniprotKB）获得。 根据所选数据库的源指定正确的解析规则。 为蛋白质和肽定义亲子假发现率 （FDR） 值 = 1。 在“无标签量化”选项卡中添加无标签定量 （LFQ） 选项。 将最小 LFQ 比率计数保持在 2。注意：在这里，我们描述了使用MaxQuant24 和Perseus软件25 分别进行蛋白质定量和后续统计分析的数据分析。但是，数据分析可以使用任何其他市售或免费的生物信息学进行。使用基于目标诱饵数据库的方法估计FDR26.肽和蛋白质FDR等于0.01意味着鉴定的肽和蛋白质预计含有1%的假阳性。 统计分析加载蛋白质组.txt文件以在蛋白质水平上执行统计分析。 将 LFQ 值定义为主列。 通过基于分类列过滤行来删除“反向”和“污染物”。 使用分类注释行对不同的实验条件进行分组。 减少数据矩阵，选择先前定义的每个组中有效值的数量。 选择更适合实验条件的统计检验（即 t检验、多样本检验方差分析）。 使用基于 FDR 的计算确定重要提示的截止值。通常，0.01 和 0.05 都被接受为调整后的 p 值的阈值。 使用火山图表示可视化基于 t 检验统计量的差分分析结果。 以.txt格式导出最终矩阵，以便进一步编辑最终结果表。注意：配置文件夹包含一个 FASTA 文件，其中包含角蛋白等蛋白质，这些蛋白质被认为是全球蛋白质组学实验中的常见污染物，在输出表中用 + 标记。在本研究中，具有两个样本条件，使用 t检验进行统计分析。 11. 蛋白质印迹结果验证 样品制备将适当体积的 4x 上样缓冲液添加到 IN、FT 和 EL 的每个等分试样中。 将样品在95°C下煮沸5分钟。 快速旋转以从试管顶部回收蒸发的样品。 SDS-PAGE和凝胶转印将样品上样于4%-12%变性聚丙烯酰胺凝胶上。 用MES SDS电泳缓冲液在120 V下运行凝胶1.5小时。 按照制造商的说明，用半干转印盒在硝酸纤维素膜上转移凝胶。我们建议在 15 V 下传输 10 分钟。 免疫检测在室温下用10%牛血清白蛋白（BSA）封闭膜1小时，同时轻轻搅拌。 根据制造商的说明，在TBST中加入在5%BSA中制备的一抗。在4°C下放置过夜或在室温下轻轻搅拌1小时。 用TBST洗涤膜三次，每次5分钟。 在室温搅拌下加入在TBST中制备的二抗1小时。 用TBST洗涤膜三次，每次5分钟。 使用印迹成像仪可视化结果。注意：为了检测TDP-43（我们RNA的已知结合剂），使用重组兔单克隆抗体，并在4°C下将膜留置过夜。 作为二抗，使用抗兔IgG辣根过氧化物酶（HRP），但荧光二抗也可以起作用。为了可视化膜上的抗体，将膜与Clarity Western ECL底物孵育1分钟，然后使用ChemiDoc成像系统成像。