トランスレーショナルペイン研究のためのオープンソースのリアルタイム閉ループ電気閾値追跡

ヒト微小ニューログラフィ実験は、ブリストル大学生命科学部研究倫理委員会によって承認されました(参照番号:51882)。すべての研究参加者は書面によるインフォームドコンセントを与えた。動物実験は、ブリストル大学動物福祉および倫理審査委員会の承認後、1986年英国動物(科学的手順)法に従ってブリストル大学で実施され、プロジェクトライセンスの対象となりました。 1. Open Ephys GUI と APTrack のインストール ソフトウェアのマニュアルを参照して、サポートされている Open Ephys グラフィカル・ユーザー・インターフェース (GUI) の最新バージョン (https://github.com/Microneurography/APTrack#readme) を見つけ、GUI をダウンロードしてインストールします。 次の URL から互換性のあるバージョンの GUI をインストールします。 https://github.com/open-ephys/plugin-GUI/releases。 GitHub から最新バージョンをダウンロードします: https://github.com/Microneurography/APTrack/releases。Windows コンピューターの場合は、.dll ファイルをプラグイン フォルダー (通常は C:\Program Files\Open Ephys\plugins) にコピーします。MacOS コンピューターの場合は、.bundle ファイルをパッケージの [コンテンツ/プラグイン] フォルダーにコピーします。 2.記録刺激装置の組み立て 製造元が提供するケーブルを使用して集録ボードをコンピュータに接続し、電源を入れます。注:ヒトマイクロニューログラフィーでは、USB 3.0アイソレータを使用して参加者をコンピューターから電気的に隔離し、取得ボードはげっ歯類の研究に使用される主電源電圧電源とは対照的にポータブルバッテリーで駆動されました。ステッピングモーター制御ボードを除くすべてのUSB接続は、人間の研究中にUSBアイソレーターを通過しました。 I/Oボードを集録ボードのアナログ入力ポートに接続します。シリアル・ペリフェラル・インターフェース(SPI)ケーブルを使用して、Intan RHD記録ヘッドステージをアクイジション・ボードに接続します。注:ここではIntan 16チャンネルバイポーラヘッドステージを使用しましたが、他のモノポーラRHD2000シリーズヘッドステージを使用することもできます。 パルスパルをコンピュータ22に接続する。PulsePalを使用してアナログ電圧制御刺激装置(DS4など)で組み立てるには、マウスのからかいファイバー録音と同様に、手順2.5.1〜2.5.3に従います。ステッピングモーターを使用してロータリーエンコーダベースの刺激装置(DS7など)で組み立てる場合は、人間のマイクロニューログラフィ記録と同様に、手順2.6.1-2.6.8に従います(図1)。 以下で説明するように、GUIでシグナル・チェーンを構築します。Rhythm FPGAプラグインを左クリックしてシグナルチェーンにドラッグし、シグナルチェーンに挿入します。これにより、GUIがアクイジション・ボードに接続されます。ADCボタンをクリックして、I/OボードからADCチャンネルの記録を開始してください。ADCボタンは、オンになるとオレンジ色に点灯します。注:以前に記録した実験データを再生したい場合は、Rhythm FPGAの代わりにファイルリーダープラグインを最初に使用できます。これをAPTrackと組み合わせて使用 すると、以前の実験での活動電位の視覚化と遅延追跡が可能になります。 バンドパス・フィルタをシグナル・チェーンに挿入します。デフォルト設定の300〜6,000 Hzは、人間とマウスの両方の記録に適しています。さらに、その後にスプリッターを挿入します。 APTrackプラグインをスプリッターの片側のシグナルチェーンに挿入し、反対側のLFPビューアを挿入します。LFPビューアは、従来のオシロスコープのような電圧トレースビューを提供し、実験中に役立ちます。 プラグインの後にレコードノードを挿入します。ドロップダウンメニューで、データ保存形式をバイナリからOpen Ephysに変更します。これにより、適切に機能する単純なシグナル・チェーンが完成します(図2)。しかしながら、追加の成分は、実験要件によって決定されるように追加され得る。注:シグナル・チェーン内のプラグインの前にレコード・ノードを配置した場合、活動電位トラッキング情報は保存されません。 GUIの右上にある再生ボタンをクリックして、アクイジションボードからのデータの送信と視覚化を開始します。録音を開始するには、再生ボタンの横にある円形の録音ボタンをクリックします。注:レコードをクリックするのを忘れがちです。これを防ぐために、取得を開始した瞬間からデータを記録します。 アナログ電圧制御刺激装置で組み立てるには、以下に説明する手順に従ってください。アナログ電圧入力によって刺激振幅が制御される定電流刺激装置の電源を入れます。この場合、DS4を使用しました(図1)。 PulsePal出力チャンネル1は、アナログ電圧コマンド用です。この信号をBNC Tスプリッタで分割し、定電流刺激器入力とI/Oボードに接続して指令電圧を記録します。 PulsePal出力チャンネル2は、電気刺激TTLイベントマーカー用です。これをI / Oボードに接続して、プラグインが使用する刺激TTLイベントマーカーと事後分析が記録されるようにします。 アナログ電圧制御刺激装置で組み立てるには、以下に説明する手順に従ってください。回転式符号化ダイヤルによって刺激振幅が制御される定電流刺激装置の電源を入れます。この場合、DS7を使用しました(図1)。 メーカー提供のケーブルと磁気マウントを使用して、ステッピングモーター制御ボードをステッピングモーターに接続します。 標準のUSB A-USBマイクロBケーブルを使用して、コントロールボードをコンピューターに直接接続します。USBアイソレータの参加者側の制御ボードは、12Vの主電源にも接続されているため、接続しないでください。 コントロールボードを初めて使用する場合は、ステッピングモータースクリプトをGitHubからコントロールボードにアップロードします。これは、一度だけ、またはステッピングモータースクリプトのソフトウェアアップデートがリリースされた場合にのみ実行する必要があります。 定電流刺激装置の刺激振幅ダイヤルを0mAに設定します。カスタム取り付けブラケットを使用して、ステッピングモーターと刺激振幅ダイヤルをインターフェースします。これらは3Dプリントできるため、安価で迅速、かつカスタマイズ可能な取り付けソリューションが可能になります。GitHub に問い合わせて、選択した刺激装置用にマウントが既に設計されているかどうかを確認してください。 カスタムバレルアダプターを使用して、ステッピングモーターバレルを刺激振幅制御ダイヤルに接続します。これらのアダプターは、強度と耐久性の理由から金属で構成する必要があります。ただし、定期的に交換する必要があるかもしれませんが、3Dプリントされた部品も適しています。GitHubを参照して、選択した刺激装置用にバレルアダプターがすでに設計されているかどうかを確認してください。 カスタムマウントとバレルアダプターを使用して、コントロールボード/ステッピングモーター装置を刺激装置コントロールダイヤルに緩く取り付けます。注意: ソフトウェアが起動され、ステッピングモーターが自動的に位置ゼロに設定されると、マウントとバレルアダプターは後で締められます。 プロトコルステップ2.5.2-2.5.3(出力チャンネル1をスティミュレーターに接続することを除いたもの)で説明されているようにPulsePalを接続します。さらに、出力チャンネル2をDS7スティミュレータに接続してトリガします。 マウスの皮膚神経製剤を下記のように調製する。生後2〜4か月のC57BL / 6Jマウス(この研究では、英国チャールズリバーラボラトリーズ)に、餌と水を 自由摂取で提供します。 ペントバルビタールナトリウム(≥200 mg/kg)の腹腔内注射による麻酔薬の過剰摂取による淘汰と循環の停止を確認した後、Zimmermannらによって記述された方法を使用して、マウスの後足の背側とこの領域を神経支配する伏在神経から皮膚を解剖します23。 皮膚神経製剤を、特注のデュアルチャンバーアクリルバス(15 mL /分の灌流速度、30 mL容量)の半分で30〜32°Cで30〜32°Cに維持します。小さな穴からミネラルオイルで満たされたチャンバーに神経を通し、ワセリンで密封します。オイルは絶縁された記録環境を提供します。 超微細鉗子を使用して神経幹から2本の細いフィラメントを取り除き、バイポーラ銀/塩化銀記録電極の両側に1本ずつ吊るします。 RHD2216 16チャンネル・バイポーラ・ヘッドステージを使用してニューラル信号をデジタル化および増幅し、アクイジション・ボードを使用して処理します。300〜6,000 Hzのバンドパスフィルターを使用して30 kHzで信号をサンプリングし、GUIを使用して視覚化します。 鈍いガラス棒を使用して、製剤の皮膚をなでます。低振幅質量活性を使用して、プレパレーションが生きていることを確認します。 以下に説明するようにヒトC線維微小ニューログラフィを行う。前述のように、書面によるインフォームドコンセントを提供した参加者とマイクロニューログラフィーを実施します24。 参加者をベッドに快適にリクライニングさせ、枕で支えた状態で、超音波スキャナーを使用して表在性腓骨神経を特定し、外側くるぶしの約5〜10 cm近位のターゲット領域をマークします。 70%アルコールワイプ中の2%クロルヘキシジンを使用して標的領域の周囲の皮膚を滅菌し、滅菌参照電極を目的の記録部位の近くの皮下、すねの中レベルで挿入します。 滅菌記録電極を、ターゲット領域内の超音波ガイダンスの下で表在腓骨神経に挿入します。 RHD2216 16チャンネル・バイポーラ・ヘッドステージを使用してニューラル信号をデジタル化および増幅し、アクイジション・ボードを使用して処理します。300〜6,000 Hzのバンドパスフィルターを使用して30 kHzで信号をサンプリングし、GUIを使用して視覚化します。注:アクイジション機器は、5 kV RMS絶縁のUSB 3.0アイソレータによってラップトップから電気的に絶縁され、カスタムメイドの12Vバッテリ電源 を介して 電力を供給されました。 皮膚を優しくなでて機械的に誘発された質量活動を明らかにすることにより、神経内ポジショニングが成功したことを確認します。さらに、参加者は通常、神経内ポジショニングが成功すると、足の背外側の感覚異常を報告します。 3. ソフトウェアのセットアップと末梢神経細胞の同定と表現型 以下の説明に従ってソフトウェアをセットアップします。GUIを開きます(図3)。ステッピングモーター制御ボードがPCに接続されている場合、それが検出され、位置ゼロに設定されます。刺激装置の刺激振幅ダイヤルとステッピングモーターの両方がゼロに設定されているため、手順2.6.5〜2.6.7で説明されているカスタムマウントとバレルアダプターを締めます。注意: ステッピングモーターと刺激振幅ダイヤルの両方が「ゼロ」になっていない場合、ステッピングモーターがコントロールダイヤルをその範囲外に回そうとすると、損傷を引き起こす可能性があります。 オプションメニューで、 トリガーチャンネルを選択します。パルスパル出力チャンネル2から電気刺激TTLマーカーを含む ADCチャンネル を選択します。 オプションメニューで、データチャンネルを選択し、電気生理学的 データを含むチャンネルを選択します。 刺激コントロールパネルで、スライダーを使用して初期、最小、および最大の刺激振幅を定義します。TTLマーカーが生成されるように、電流刺激が0より上に設定されていることを確認してください。注意: 一部の刺激装置は、入力と出力のスケーリング比が1:1ではありません。適切な刺激振幅を選択する際には、この点を考慮してください。例えば、定電流刺激装置からのより高い出力を達成するために、いくつかの刺激システムでは1:10の出力比を選択することができる。 刺激コントロールパネルで、Fをクリックして刺激指示を含むファイルをロードします。電気刺激プロトコルは、目的の刺激周波数と持続時間で構成されるカンマ区切り値(CSV)ファイルとして保存されるため、ユーザーは実験用の複雑な刺激パラダイムを作成できます。テンプレートの例は、こちらから入手できます。 https://github.com/Microneurography/APTrack/blob/main/example_playlist.csv 刺激コントロールパネルで、>をクリックして、ロードされた刺激パラダイムを開始します。デフォルトでは、APTrackは、定電流刺激装置の刺激振幅を制御するために、さまざまな振幅の0.5ミリ秒の持続時間の正の方形波パルスを生成するようにPulsePalに要求します。 時系列ラスタープロットは、電気刺激に対する応答で更新を開始し、新しい刺激応答ごとに右側に新しい列として表示されます。 単一ニューロンの活動電位を視覚化して識別します。単一ニューロンの活動電位の検出を成功させるには、適切な画像閾値を設定することが重要です。時系列ラスター プロット パネルで、画像の低、検出、および高の閾値を調整します。オプションメニューで配色を選択します。WHOT(ホワイトホット)モード(デフォルト)では、低画像スレッショルドを下回る電圧は黒でエンコードされます。低画像と検出スレッショルドの間の電圧はグレースケールでエンコードされます。検出スレッショルドを超える電圧は緑色でエンコードされ、高画像スレッショルドを超える電圧は赤色でエンコードされます。 末梢ニューロンは、低い刺激周波数(<0.25Hz)で一定の潜時応答を示し、これらの応答は、それらの伝導速度および刺激部位と記録部位の間の距離によって決定される。適切な画像しきい値を設定すると、アルゴリズムによって検出されたしきい値超過イベントが緑色でエンコードされます(図4)。 記録されている神経によって神経支配されている皮膚領域の周りで刺激電極を体系的に動かし、各部位で最低3つの刺激イベントを可能にします。各電気刺激イベントの後の同じ時点で発生する閾値交差イベント(緑色でマーク)の時系列ラスタープロットを監視します。注:マウスでは、5 mAの検索刺激が使用されました。ヒトでは、経皮的電気検索刺激の振幅は、7/10を超えないように口頭による疼痛評価まで滴定された。 同じ潜時および同じ刺激位置で連続して現れる3つのしきい値交差イベント(緑色のバー)を確認します。これは、末梢ニューロン活動電位の同定を示す。 ターゲットニューロンの受容野の最も電気的に敏感な点を特定することにより、刺激電極の位置を最適化し、電極を所定の位置に固定します。ヒトマイクロニューログラフィのこの時点で、バイポーラ電気刺激に皮内電気鍼治療針(直径0.2 mm)を使用するように切り替え、マウスでは、刺激位置が一定になるようにカスタム経皮刺激プローブを使用します。 末梢ニューロンの分類と感覚表現型を実行します。シミュレーション振幅を手動で調整するか、必要に応じてAPTrackを使用して、ターゲット活動電位の電気的しきい値を推定します(手順4.1〜4.2で説明)。 感覚表現型プロトコル全体で、0.25Hzの周波数で推定電気閾値の2倍で受容野を刺激します。 伝導距離を伝導潜伏時間で割ることにより、ニューロンの伝導速度を計算します。C繊維は≤2 m/sの伝導速度で識別できます。 フォン・フレイフィラメントを使用して受容野を機械的に刺激し、活性化の機械的閾値を決定します。機械感覚は、電圧トレースに見える誘発活動電位と、十分な力でニューロン(Cファイバーの場合は)の潜時の増加によって識別できます。 ニューロンの受容野を加熱し、十分な熱を加えると、電圧トレースで見える活動電位とニューロンの潜時の増加(Cファイバーの場合)を再び監視します。熱に敏感でないニューロンは、軸索伝播に対する熱力学的効果のために潜伏期の減少を示す。注:ヒトマイクロニューログラフィーでは、TSC-IIを使用して迅速かつ正確な熱制御を行います。マウスの準備では、周囲の液体への急速な熱放散を制限しながらニューロン終末へのアクセスを可能にするために、受容野の上に置かれたアルミニウム隔離チャンバーに加温または冷却された合成間質液を追加します。熱電対を使用して温度を記録します。 受容野を冷却し、電圧トレースに見える活動電位と、十分な低温適用時にニューロンの潜伏時間が著しく増加するのを再び監視します。すべてのニューロンは、軸索伝播に対する熱力学的効果のために潜時の増加を示すため、潜時の増加のみに基づいてニューロンを冷感症としてラベル付けする場合は注意してください。 4.遅延と電気的しきい値の追跡 以下で説明するように、待機時間の追跡を実行します。時系列ラスタープロットで単一ニューロンの活動電位を特定したら、時系列ラスタープロットの右側にある灰色の線形スライダーを移動して、検索ボックスの位置を調整します。 時系列ラスター プロットの下で、検索ボックスの幅の回転スライダーを適切な幅に調整します。検索ボックスの幅を狭くして、過渡ノイズスパイク、自発発的に発火する活動電位、またはその他の近くの一定の遅延活動電位が目的の活動電位として誤認される可能性を減らします。 ターゲット活動電位の追跡を開始するには、マルチユニット追跡テーブルの下にある+をクリックします。待ち時間の位置、2〜10刺激を超える発火率(オプションメニューで調整)、検出されたピーク振幅など、ターゲット活動電位の詳細を含む新しい行がテーブルに追加されます。 活動電位がマルチユニットトラッキングテーブルに追加されると、その後の電気刺激ごとにレイテンシトラッキングアルゴリズム(図5)が自動的に実行されます。 時系列ラスター プロットに複数の離散活動電位が表示されている場合は、上記のようにそれらを複数ユニット追跡テーブルに追加します。同時遅延追跡のためにテーブルに追加できる活動電位の理論上の最大数は、最大 32 ビット整数値です。 マルチユニット トラッキング テーブルの [Track Spike ] チェックボックスをオンにして、遅延トラッキング アルゴリズムによって決定される特定の活動電位の適切な位置に検索ボックスを移動します。これにより、レイテンシートラッキングをリアルタイムで監視し、トラッキングが期待どおりにアクティビティポテンシャルに従っていることを確認できます。他のスパイクの待機時間の追跡は、バックグラウンドで通常どおり続行されます。 各行の最後にある削除ボタンを使用して、複数ユニットの追跡テーブルから追跡された活動電位を削除します。 以下に説明するように、電気的しきい値トラッキングを実行します。刺激コントロールパネルの増分率と減分率を0.1 Vから0.5 Vの間で調整します。 これらの値は等しく保ち、これが実験パラダイムの一部でない限り、実験中に調整しないでください。 刺激周波数の変調が実験パラダイムの一部でない限り、刺激周波数が適切なレート(通常は0.25〜0.5Hz)に設定されていることを確認してください。侵害受容器の発火率を増加させると、侵害受容器の電気的閾値が変化する可能性がある。 活動電位が正常に追跡されたら、マルチユニット追跡テーブルの[追跡しきい値]ボックスにチェックマークを付けると、電気的 しきい値追跡 アルゴリズムが開始されます(図6)。注意: 電気的しきい値追跡は、ターゲット活動電位でのみ実行されます。実際、マルチユニットトラッキングテーブル内の他の活動電位の発火率は、刺激振幅が変化するにつれてそれに応じて更新されます。 刺激振幅を手動で調整して、電気的しきい値の推定値にします。これにより、電気的しきい値を決定するための待ち時間が短縮されます。信頼できる電気的閾値を確立するのにかかる時間は、刺激周波数、増加率および減少率、ならびに初期刺激からニューロンの電気的閾値までの刺激振幅の差に依存する。 ソフトウェアは、ニューロンの電気的閾値の推定にアップダウン法を使用します。マルチユニットトラッキングテーブルでは、発火率は2〜10回の以前の刺激(オプションメニューで選択)にわたって決定されます。考慮する刺激イベントの数を選択します。数値を大きくすると、しきい値推定値の信頼性は高まりますが、達成に時間がかかります。 人間のマイクロニューログラフィーでは、過度の参加者の不快感を防ぐために、電気刺激の痛みを監視することが重要です。侵害受容器、特にサイレント/睡眠中のCファイバーの研究中に、いくらかの不快感は避けられません。.電気的しきい値追跡中に刺激振幅が増加する間、定期的に痛みの評価を尋ね、定電流刺激装置の近くに留まり、参加者の要求に応じてそれを解除します。注意: または、刺激コントロールパネルの [ ]ボタンをクリックして、ユーザーインターフェイスから電気刺激を解除することもできます。 50%の発火率は、おおよその電気的しきい値が決定されたことを示します。 電気的閾値追跡中に、温度または薬物操作などの受容野に実験的操作を適用する。侵害受容器の電気的閾値に対するこれらの操作の影響が追跡されます。注意: 実験操作後に新しい侵害受容器のしきい値を特定するのに十分な時間を確保してください。.