2次元ヒト幹細胞由来心筋細胞における心収縮性調節療法の評価

このプロトコルに記載されているのは、柔軟なヒドロゲル基板上に目に見えて収縮する2D hiPSC-CM単層を生成するためのシンプルで堅牢なツールです。収縮特性の測定は、収縮性分析ソフトウェアと組み合わせたビデオベースの記録によって達成される。これにより、収縮振幅、収縮勾配、弛緩勾配、ピークまでの時間、ベースラインまでの時間90%、収縮持続時間50%など、心筋細胞の収縮性の主要なパラメータを定量化できます。このモデルは、さまざまな「健康な」ドナーからのhiPSC-CMのベースライン収縮特性(図4)を特徴付けるために使用され、心臓電気生理学医療機器信号(すなわちCCM)の評価に拡張することができます。標準的なCCM刺激パラメータ(図1D)29,30の適用は、in vitroで収縮特性の増強をもたらした(図5および表1)17。 さらに、この方法を使用して、CCM刺激の有無にかかわらず、細胞外カルシウム濃度の調節がヒトの収縮特性に及ぼす影響を評価できることを実証しました(図6)17。収縮の予想されるベースラインカルシウム依存性は、心筋細胞単層のレベルでのカルシウム感受性のCCM誘発性の増加と同様に観察された7,17。さらに、β-アドレナリン作動性シグナル伝達経路の薬理学的調査(図7)は、CCM誘発変力効果がβ-アドレナリン作動性シグナル伝達によって部分的に媒介されることを明らかにした17。さらに、このツールは、拡張型心筋症(DCM)33,34,35(図8)を含む患者固有の疾患心筋細胞に拡張して、病状の文脈におけるCCMの効果を理解することができます。実際、ここでテストしたCCM「用量」では、収縮振幅の増強と収縮および弛緩の速度論の加速が観察されました(図8)。私たちの研究室にはCCM模倣装置がありますが、ここで使用されている方法論はそのシステムに固有ではなく、他の心臓電気生理学装置にも適用できます。 図1:2D hiPSC-CM in vitro CCMモデルの概略図。 (A)hiPSC-CMは、ゼラチン(0.1%)コーティングされた6ウェルプレートに単層フォーマットでプレプレーティングされています。(B)培養2日後、hiPSC-CMを解離し、柔軟なヒドロゲル基板上にプレーティングするための調製を行います。(C)単離されたhiPSC-CMを48ウェルフォーマットで配列したヒドロゲル基質上に高密度で播種し(左)、細胞外カルシウムチロード溶液(0.5 mM)でアッセイします(右)。(D)市販のパルス発生器および標準的な臨床CCMパルスパラメータ29,30(右)を使用して、hiPSC-CMを刺激する。心機能はビデオベースの分析によって評価されます(左)。(E)CCM前(ベースライン:5 V)、CCM中(CCM:10 V)、およびCCM後(回復:5 V)の代表的な収縮記録。この図は、Feaster et al.17から転載されています。略語:hiPSC-CM =ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞;CCM =心収縮性変調。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2:フレキシブルヒドロゲル基板のプレーティングおよびシードの概略図 。 (A)完全に解凍した希釈されていないECMベースのヒドロゲル基質を滅菌48ウェルプレート(左パネル)に塗布し、ウェルあたり1μLのヒドロゲル基質(右パネル)を使用します。(B)ヒドロゲル基質を室温で8〜10分間インキュベートし(右パネル)、続いて高密度hiPSC-CMを低媒体容量(~200μL)でプレーティングします(左パネル)。(C)10〜15分のインキュベーション後、培地を各ウェルに添加し(左パネル)、プレートを標準的な組織培養インキュベーター(右パネル)に移します。略語:ECM =細胞外マトリックス、hiPSC-CM =ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞;RT =室温。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3:細胞外マトリックスベースのヒドロゲル基質 。 (a)代表的なヒドロゲル基質(細胞なし)を48穴ガラス底板の1ウェルに基板を塗布した直後。(b)hiPSC-CMが播種された後の時間0。(c)hiPSC-CMを播種してから24時間の時間。このパネルは、Feaster et al.17から転載されました。白い矢印は、ヒドロゲル基質の端部を示し、4倍の倍率を示す。スケールバー= 1 mm。略称:hiPSC-CM = ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図4:2D hiPSC-CM単層収縮特性の特性評価。 (A)1Hz(5V)でペーシングした2D hiPSC-CMの代表的な収縮記録。(B)1つの収縮サイクルを表す代表的な収縮痕跡。(C)要約棒グラフ。データはSEM±平均値である。 n = 18。略称:hiPSC-CM = ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図5:2D hiPSC-CM収縮特性に対するCCMの急性効果。 (A)CCM前(5 V)、CCM中(10 V)、およびCCM後(5 V)の代表的な収縮記録。(B)即時効果の代表的な収縮痕跡(すなわち、最後のCCM前拍動、最初のCCM拍動、および最初の後CCM拍動、+で示される)。(C)即時効果の要約棒グラフ。変化率、データはSEM±平均値である。 n = 23。*p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.001, ****p < 0.0001.この図は、Feaster et al.17から転載されています。略語:hiPSC-CM =ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞;CCM =心収縮性変調。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図6:CCM応答に対する細胞外カルシウム調節の影響。 (A)CCM前(5 V)、CCM(10 V)、およびCCM(5 V)後の各グループの即時効果の代表的な収縮痕跡。hiPSC-CMは、0.25〜2 mMの細胞外カルシウム(Cao)濃度の増加にばく露されました。(B-D)収縮特性(すなわち、振幅および動態)のカルシウム感受性に対するCCMの効果を実証する眼を導くための変換データ(シグモイド)(丘の傾き= 1.0)。n = グループあたり6〜8。この図は、Feaster et al.17から転載されています。略語:hiPSC-CM =ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞;CCM =心収縮性変調。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図7:薬理学的課題。CCM前(5 V)、CCM(10 V)、およびCCM(5V)後の各グループの代表的な収縮トレース。hiPSC-CMを(A)ビヒクルまたは(B)メトプロロール(2μM)で前処理した。(C,D)各条件のサマリー棒グラフ。変化率、データはSEM±平均値である。 n=1群あたり10。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.この図は、Feaster et al.17から転載されています。略語:hiPSC-CM =ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞;CCM =心収縮性変調。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図8:罹患した2D hiPSC-CMの収縮特性に対するCCMの急性効果。 (A)DCM L35P、対照ベースライン(6 V以前)、およびDCM L35PとCCM(10 V)の代表的な収縮トレース。(B)要約棒グラフ。変化率、データはSEM±平均値である。 n = 3。*p < 0.05, **p < 0.01.略語:hiPSC-CM =ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞;CCM =心臓収縮性調節;DCM =拡張型心筋症。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 補足ビデオS1:細胞外マトリックスベースのヒドロゲル上のhiPSC-CMのタイムラプス。 柔軟なヒドロゲル基材にめっきされた2次元hiPSC-CM。時間:0-90時間;48ウェルガラス底板の1ウェル;4倍の倍率。hiPSC-CMは水平単層シンシチウム(左から右)を形成します。スケールバー= 1 mm。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足ビデオS2:細胞外マトリックスベースのヒドロゲル上のhiPSC-CM。 柔軟なヒドロゲル基材にめっきされた2次元hiPSC-CM。時間: ~24時間;48ウェルガラス底板の1ウェル;4倍の倍率。hiPSC-CMは単層形態を形成し、めっき後~24時間で強固な収縮を示します。スケールバー= 1 mm。このビデオはFeasterら17からのものです。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 パラメーター ティッカー 後 振幅 16 ± 4%** 4 ± 5% ピークまでの時間 50% -20 ± 9%* 7 ± 5% ピークまでの時間 90% -22 ± 8%* 6 ± 5% ベースラインまでの時間 50% -8 ± 5% 4 ± 4% ベースラインまでの時間 90% -12 ± 6%* 5 ± 5% 収縮期間10% -13 ± 6% 3 ± 5% 収縮持続時間 50% -6 ± 5% 3 ± 5% 収縮持続時間 90% 0 ± 5% 3 ± 4% N 23 23 表1:収縮特性。CCM前(5 V)に対する変化率。データは、CCM(10 V)中およびCCM(5 V)後の各グループのすべての拍についてSEM±平均です。n = 23。*p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.001, ****p < 0.0001.この表は、Feaster et al.17から転載されています。