RNA Yapısının Dimetil Sülfat Mutasyonel Profillemesi ile İn Vitro ve İn Hücre Dizilimi ile İncelenmesi

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, yazılımlar, reaktifler, aletler ve hücrelerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu’na bakın. 1. Gen-spesifik in vitro DMS-MaP RNA in vitro transkripsiyonuİlgilenilen RNA’nın dizisini çift sarmallı (ds) DNA olarak elde edin (örneğin, önceden var olan / genomik DNA’dan DNA fragmanları, plazmidler veya PCR olarak). DNA dizisi bir polimeraz promotoru içeriyorsa, adım 3’e atlayın. İstenilen DNA fragmanının yukarı yönünde bir RNA polimeraz promotor bağlamak için örtüşen PCR gerçekleştirin (T7 polimeraz için ileri astar: 5′ TAATACGACTCACTATAGG + hedef dizi 3’ün ilk bazları). In vitro DNA fragmanını RNA’ya aktarın. RNA’yı daima buzun üzerinde tutun. DNA’yı bir DNaz kullanarak sindirin. RNA’yı sütun tabanlı bir yaklaşım (adım 2.4) veya etanol çökeltmesi (adım 2.5) kullanarak izole edin. Uygun bir hacimde sülte, ~ 50 μg’lik bir verim bekleyin. RNA bütünlüğünü bir agaroz jeli üzerinde çalıştırarak sağlayın; RNA’yı çalıştırmadan önce 70 ° C’de 2-3 dakika boyunca denatüre edin.NOT: Tampon ve agaroz, RNA’yı bozan ve RNA örneğini kirletebilecek RNazlar içerebilir. Prekast agaroz jelleri daha önce bu laboratuvarda kullanılmıştır; Sonuçlar (özellikle RNA ile) zaman zaman belirsiz olmuştur. En iyi sonuçlar agaroz veya PAGE jelleri ile elde edildi. RNA’nın doğrudan kullanımı, çözülmeden sonra bozulma görülmedikçe RNA’yı birkaç ay boyunca -80 ° C’de saklayın. İn vitro DMS modifikasyonu (105 mM DMS’de)Yeterli miktarda yeniden katlanır tampon hazırlayın (0.4 M sodyum kakodilat, pH 7.2, 6 mM MgCl2 içerir).NOT: Her reaksiyon için (100 μL’lik son hacim), 89 μL yeniden katlanır tampon ekleyin. Her reaksiyon için, 89 μL yeniden katlanır tamponu belirlenmiş bir 1,5 mL tüpe aktarın ve kimyasal bir davlumbazın altına yerleştirilmiş bir termoshaker’da 37 ° C’de ön ısıtın.NOT: DMS oldukça toksiktir ve bir indirgeyici madde tarafından söndürülene kadar daima kimyasal bir davlumbazın altında tutulmalıdır. 10 μL nükleaz içermeyen suda (NF H2O) 1-10 pmol RNA salınımlı; bir PCR tüpüne transfer. RNA’yı denatüre etmek için 95 ° C’de bir termosikler içinde 1 dakika boyunca inkübe edin. Yanlış katlanmayı önlemek için hemen bir buz bloğuna yerleştirin. RNA örneğini 37 ° C’de yeniden katlanır tampon ile belirlenen tüpe ekleyin, iyice karıştırın ve RNA’yı yeniden şekillendirmek için 10-20 dakika boyunca inkübe edin.NOT: Çoğu RNA, milisaniyeler ila saniyeler arasında katlanacaktır, ancak istisnalar16 vardır. RNA örneğine 1 μL% 100 (10.5 M) DMS ekleyin ve dakikada 800-1.400 dönüşte (rpm) sallanırken 5 dakika boyunca inkübe edin.NOT: DMS hidrofobik olduğundan ve yeniden katlanan tamponda tamamen çözünmeyebileceğinden, bu adımda sallama (veya diğer karıştırma yöntemleri) çok önemlidir. Reaksiyon sürelerindeki sapmalar, DMS reaktivitelerinin tekrarlanabilirliğini etkileyebilir. Pipetleme hatasını en aza indirmek için DMS, numuneye eklenmeden önce 0 etanol içinde çözülebilir, eğer son konsantrasyon %1 (105 mM) DMS korunursa. Arıtılmamış bir kontrol için DMS, dimetil sülfoksit (DMSO) veya su ile değiştirilebilir. 5 dakikalık reaksiyon süresinden sonra, 60 μL% 100 β-merkaptoetanol (BME) ile söndürün, iyice karıştırın ve RNA’yı hemen buzun üzerine yerleştirin.NOT: RNA, temizlemek için reaksiyonu BME ile söndürdükten sonra davlumbazdan güvenli bir şekilde çıkarılabilir. Bununla birlikte, BME’nin çevreye doğrudan maruz kalması, güçlü kokusu ve tahriş edici özellikleri nedeniyle hala önlenmelidir. RNA’yı sodyum asetat-etanol çökeltmesi (bkz. adım 2.5) veya sütun bazlı bir yaklaşımla (bkz. adım 2.6) temizleyin ve 10 μL suda salın. RNA’yı bir spektrofotometre kullanarak sayısallaştırın. Modifiye RNA’yı -80 ° C’de depolamanın doğrudan kullanımı.NOT: DMS tedavisinden sonra RNA daha az kararlı olduğu için uzun süreli depolamadan kaçınılmalıdır. Modifiye RNA’nın gen-spesifik RT-PCR’siNOT: DMS ile işlenmiş parçaların RT-PCR kurulumu için Şekil 1’e bakın.10 μL nükleaz içermeyen (NF)H2O’da 100 ng modifiye RNA’nın salınımı Bir PCR tüpüne transfer. Tüpe 4 μL 5x birinci iplik tamponu (FSB), 1 μL dNTP karışımı (her biri 10 mM), 1 μL 0.1 M ditiyotreitol (DTT) (donma-çözülme döngülerinden kaçının), 1 μL RNaz inhibitörü, 1 μL 10 μM ters primer (tek astar veya bir astar havuzu) ve 1 μL TGIRT III ekleyin.NOT: Bir astar havuzu için, her bir astarın 10 μM’lik 1 μL’sini doğrudan RT’ye eklemeyin; Bunun yerine, önce astarları karıştırın ve karışımdan 1 μL ekleyin (toplam 10 μM astar konsantrasyonunda). Bir termosiklette 30 dakika ila 1,5 saat arasında 57 ° C’de (tipik olarak, 500 nt’lik bir ürün yapmak için 30 dakika yeterlidir) inkübe edin. 1 μL 4 M NaOH ekleyin, pipetle karıştırın ve RNA’yı bozmak için 3 dakika boyunca 95 ° C’de inkübe edin.NOT: Bu adım, RNA’yı bozarak TGIRT’yi cDNA’dan serbest bıraktığı için çok önemlidir. Atlanırsa, aşağı akış PCR etkilenebilir. Astarları yeterince uzaklaştıran ve 10 μL NF H 2 O’da salınım yapan sütun tabanlı bir yaklaşım (bkz. adım2.6) kullanarak temizleyin. PCR-reaksiyonun 25 μL’si başına ters transkripsiyon ürününün 1 μL’sini kullanarak cDNA’yı, verim ve sadakati dengelemek için tasarlanmış bir PCR kiti ile yükseltin.NOT: Astarlar ~ 60 °C erime sıcaklığına sahip olmalıdır. PCR başarısını doğrulamak için PCR ürününün 2 μL’sini bir agaroz jeli veya prekast agaroz jeli üzerinde çalıştırın. İdeal olarak, PCR’den sonra sadece bir bant gösterilmelidir. Öyleyse, sütun tabanlı bir yaklaşım kullanarak reaksiyonu temizleyin. Alternatif bantlar varsa, jelden doğru bandı çıkarmak için kalan PCR reaksiyonunu kullanın. Yeterince küçük bir hacimde (örneğin, 10 μL) sülte. Bir spektrofotometre kullanarak çıkarılan parçaları ölçün. İstenilen dizileme platformuna uygun bir yaklaşım kullanarak dizileme için dsDNA parçalarını dizine ekleyin. Resim 1: DMS ile işlenmiş büyük parçaların RT-PCR’si için deney düzeneği. Modifiye edilmiş bir RNA üzerinde ters transkripsiyon yapılırken, astarın tavlandığı dizi üzerindeki modifikasyonlar kaydedilmeyecektir. Bu nedenle, parçaların uzunluğu 400-500 bp’yi aştığında, burada örneklendiği gibi, astar bölgelerinde üst üste binen parçaların tasarlanması gerekir. Parçaların uzunluğu, sıralama ihtiyaçlarına bağlıdır. Eşleştirilmiş uçlu 150 döngü dizilimi kullanıldığında, parçalar 300 bp’yi geçmemelidir. Kısaltmalar: RT-PCR = ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu; DMS = dimetil sülfat. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 2. Virüs bulaşmış hücreleri kullanan tüm genom DMS-MaP NOT: Hücrelerde, DMS tedavisi yukarıda açıklanan gen-spesifik amplifikasyon yaklaşımı ile de birleştirilebilir. Tüm genom kütüphanesi, tek bir gen üzerinde tam kapsama alanı elde etmek için muazzam bir dizileme derinliği gerektirir. Bununla birlikte, viral RNA’lar ekstraksiyondan sonra ribodeplemiş RNA’nın önemli bir bölümünü oluşturuyorsa, tüm genom dizilimi uygun olacaktır. Ayrıca, diğer zenginleştirme yöntemleri tüm genom kütüphanesi oluşturma yöntemiyle birleştirilebilir. DMS tedavisiİstenilen enfeksiyon aşamasına kadar virüsle enfekte olmuş hücreleri büyütün. Hücre kabını, hem virüsleri gerekli biyogüvenlik seviyesinde hem de DMS gibi ajanlar tarafından üretilen kimyasal dumanları işlemek için uygun olan özel bir duman davlumbazına aktarın. Kültür ortamına% 2,5’lik bir DMS hacmi ekleyin ve kabı (tipik olarak 10 cm’lik bir plaka) parafilm ile kapatın.NOT: DMS ile az değişiklik yapmak ve aşırı değiştirmek kolaydır. DMS’yi doğrudan hücrelere eklerken, iyice karıştırmak çok önemlidir. Alternatif olarak, yeni ortamı 37 ° C’de 50 mL’lik bir konik tüp içinde önceden ısıtın ve DMS’yi doğrudan kuvvetlice sallayarak ekleyin. Harcanan ortamı hücreler üzerinde boşaltın ve DMS içeren ortamda yavaşça pipet çekin. 5 dakika boyunca 37 °C’lik bir inkübatöre aktarın.NOT: DMS’nin inkübatörün dışında tutulması için gereken süreye bağlı olarak, 5 dakikanın aşırı modifikasyona yol açması mümkündür. DMS’yi eklemekten inkübasyona kadar geçen süreyi ≤1 dakikaya kadar tutun. Deney ilk kez gerçekleştiriliyorsa, optimum modifikasyon oranını bulmak ve sonuçların bir konsantrasyon penceresinde sağlam olmasını sağlamak için bir DMS titrasyonu yapmanız ve inkübasyon süresini (3 dakika ile 10 dakika arasında) değiştirmeniz önerilir. DMS içeren ortamı dikkatlice pipetle çıkarın (uygun kimyasal atıklara) ve nazikçe 10 mL durdurma tamponu ekleyin (% 30 BME içeren PBS [örneğin, 3 mL BME ve 7 mL PBS]).NOT: DMS ve BME ilavesi, hücreler kuvvetli bir şekilde yapışmamışsa, hücreleri plakadan kaldırabilir. Hücreler kalkıyorsa, DMS içeren ortamı çıkarmak yerine süspansiyon hücreleri olarak muamele edilebilir, durdurma tamponunu doğrudan ekleyin ve DMS ve BME içeren hücreleri 50 mL’lik bir konik tüpe kazıyın. 3.000 × g’da 3 dakika santrifüj yaparak hücreleri peletleyin; Büyük damlacıklarda hücrelerin altına pelet edebilen herhangi bir kalıntı DMS’den kurtulduğunuzdan emin olun. DMS ortamı başlangıçta çıkarılamıyorsa,% 30 BME’de ekstra bir yıkama adımı önerilir. Hücreleri kazıyın ve 15 mL’lik bir konik tüpe aktarın. 3.000 × g’da 3 dakika boyunca santrifüjleme ile pelet. Süpernatantı çıkarın ve 10 mL PBS ile 2 kat yıkayın. Mümkün olduğunca fazla PBS kalıntısını dikkatlice çıkarın. Peleti uygun miktarda RNA izolasyon reaktifi içinde çözün (örneğin; bir T75 kültür şişesi için 3 mL, 10 cm’lik bir plaka için 1 mL).NOT: Reaktifin yetersiz miktarları RNA verimini etkileyebilir. RNA ekstraksiyonu ve ribozomal RNA (rRNA) tükenmesiRNA izolasyon reaktifindeki 1 mL homojenize hücreye, 200 μL kloroform, parlak pembeye kadar 15-20 s vorteks ekleyin ve daha sonra faz ayrımı görünene kadar 3 dakikaya kadar inkübe edin.NOT: Pembe lipit fazı altta yerleşmelidir. Eğer durum böyle değilse, vorteks zamanı muhtemelen yetersizdi. 4 ° C’de 15 dakika boyunca maksimum hızda (~ 20.000 × g) döndürün. Üst sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. RNA’yı sodyum asetat-etanol çökeltmesi (bkz. adım 2.5) veya sütun bazlı bir yaklaşımla (bkz. adım 2.6) temizleyin ve yeterli miktarda NFH2O hacminde salın. Bir agaroz jeli üzerindeki RNA bütünlüğünü kontrol edin. İki ribozomal alt birime karşılık gelen iki bant arayın. Tercih edilen yaklaşımı kullanarak rRNA’ları tüketin veNF H 2O’nun yeterli hacminde (tipik olarak 20-50 μL) salınımlı.NOT: Aşağı akış uygulamaları için, 8 μL’lik bir hacimde ~ 500 ng toplam RNA önerilmektedir. ribozomal olmayan RNA’lar tipik olarak toplam RNA’nın sadece% 5-10’unu oluşturur. Bir spektrofotometre kullanarak sayısallaştırın. Kütüphane oluşturmaKütüphaneler oluşturmak için genlere özgü RT-PCR veya diğer yaklaşımları kullanın15. Astarlama için rastgele hexamers kullanıyorsanız, hexamer tavlamasına izin vermek için düşük bir Tm’de (37-42 °C) bir inkübasyon adımı ekleyin.NOT: Standart kütüphane üretim kitleri, RT enzimini TGIRT ile değiştirerek ve RT sıcaklığını 57 °C’ye değiştirerek de kullanılabilir. RNA Temizleme ve Konsantratör sütunlarını kullanarak sütun tabanlı RNA temizlemeNOT: Tüm adımlar oda sıcaklığında yapılmalıdır.50 μL’lik bir hacme getirmek için numune tüpüne NF H2O ekleyin. Numuneye 100 μL bağlayıcı tampon ve 150 μL 0 etanol ekleyin. Karıştırın ve bir döndürme sütununa aktarın. 30 s için 10.000-16.000 × g’de döndürün; akış geçişini atın. 400 μL RNA hazırlık tamponu ekleyin. 30 s için 10.000-16.000 × g’de döndürün; akış geçişini atın. 700 μL RNA yıkama tamponu ekleyin. 30 s için 10.000-16.000 × g’da döndürün; akış geçişini atın. 400 μL RNA yıkama tamponu ekleyin. 30 s için 10.000-16.000 × g’de döndürün; akış geçişini atın. (İsteğe bağlı) Kolonu yeni bir toplama tüpüne aktarın ve 2 dakika boyunca 10.000-16.000 × g’de döndürün. Kolonu temiz bir RNAse içermeyen tüpe aktarın ve uygun miktarda NF H2O ekleyin. 1 dakika boyunca 10.000-16.000 × g’de döndürün. Asit fenol-kloroform RNA ekstraksiyonu.Eşit miktarda asit fenol ekleyin:kloroform:izoamil alkol. Vorteksi iyice alın ve 5 dakika boyunca 14.000 × g’de santrifüj yapın. Faz ayrımı yoksa, 20 μL 2 M NaCl ekleyin ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. 500 μL izopropanol ve 2 μL ko-çökeltici ekleyin. RT’de 3 dakika boyunca karıştırın ve kuluçkaya yatırın; daha sonra, gece boyunca -80 ° C’de inkübe edin. RNA’yı 4 ° C’de 30 dakika boyunca maksimum hızda (~ 20.000 × g) santrifüjleme ile peletleyin. Peleti 200 μL buz soğuk% 70 etanol ile yıkayın. 5 dakika boyunca maksimum hızda (~ 20.000 × g) döndürün; akış geçişini atın. Peleti uygun miktarda NFH2O ile yeniden askıya alın. Oligo Clean ve Concentrator sütunlarını kullanarak sütun tabanlı cDNA temizliğiNOT: Tüm adımlar oda sıcaklığında yapılmalıdır.50 μL’lik bir hacme getirmek için numune tüpüne NF H2O ekleyin. 100 μL bağlayıcı tampon ve 400 μL% 100 etanol ekleyin. Karıştırın ve bir döndürme sütununa aktarın. 30 s için 10.000-16.000 × g’de döndürün; akış geçişini atın. 750 μL DNA yıkama tamponu ekleyin. 30 s için 10.000-16.000 × g’de döndürün; akış geçişini atın. (İsteğe bağlı) Kolonu yeni bir toplama tüpüne aktarın ve 2 dakika boyunca 10.000-16.000 × g’de döndürün. Kolonu temiz bir RNAse içermeyen tüpe aktarın ve uygun miktarda NF H2O ekleyin. 1 dakika boyunca 10.000-16.000 × g’da döndürün. 3. Sıralama verilerinin analizi NOT: DMS-MaP dizileme verilerinden RNA ikincil yapı modelleri oluşturmak için, elde edilen .fastq dosyalarının birkaç farklı adımda işlenmesi gerekir. Bu adımlar, Adaptör dizilerini TrimGalore veya Cutadapt ile kırpın. Bowtie2 kullanarak okumaları referans dizileriyle (.fasta formatı) eşleyin. Özel RNA yapı yazılımı (örneğin, DREEM14, RNA-Framework17 veya benzeri) ile okumaları sayın ve reaktivite profilleri oluşturun. (İsteğe bağlı) DREEM14, DRACO17, DANCE-MaP18 veya benzerlerini kullanarak alternatif RNA konformasyonlarını bulmak için okumaları kümeleyin. RNAStructure12, ViennaRNA veya benzerlerini kullanarak reaktivite profillerine dayanarak minimum serbest enerji yapısını tahmin edin. RNA11 yapısını VARNA (https://varna.lri.fr/) veya benzerini kullanarak görselleştirin.NOT: Pratiklik için, DREEM (www.rnadreem.org) ve RNA-Framework19 gibi yazılımlar, analiz sürecini kolaylaştıran 1–5 adımlarını boru hatlarına büyük ölçüde dahil eder. Bununla birlikte, herhangi bir yapı tahmini dikkatle ele alınmalıdır (örneğin, yapının verilerle olan anlaşmasını doğrulayarak20.