使用硫酸二甲酯探测RNA结构 体 外 和细胞测序突变分析

注意：有关本协议中使用的所有材料、软件、试剂、仪器和细胞的详细信息，请参阅 材料表 。 1. 基因特异性 体外 DMS-MaP RNA 体外 转录获取目标 RNA 的双链 （ds）DNA 序列（例如，作为 DNA 片段、质粒或来自预先存在/基因组 DNA 的 PCR）。如果 DNA 序列包含聚合酶启动子，请跳至步骤 3。 执行重叠PCR以将RNA聚合酶促进子附着在所需DNA片段的上游（T7聚合酶的正向引物：5’TAATACGACTCACTATAGG +靶序列3’的第一碱基）。 体外将DNA片段转录成RNA。始终将RNA放在冰上。 使用脱氧核糖核酸酶消化DNA。 使用基于柱的方法（步骤2.4）或通过乙醇沉淀（步骤2.5）分离RNA。以适当的体积洗脱，预期产率为~50μg。 通过在琼脂糖凝胶上运行来确保RNA的完整性;在运行前在70°C下使RNA变性2-3分钟。注意：缓冲液和琼脂糖可能含有降解RNA并可能污染RNA样品的RNA酶。该实验室以前曾使用过预制琼脂糖凝胶;结果（尤其是RNA）有时是模棱两可的。使用琼脂糖或PAGE凝胶获得最佳结果。 直接使用将RNA在-80°C下储存数月，除非解冻后可见降解。 体外 DMS 修改（在 105 mM DMS 下）制备足够量的复性缓冲液（0.4M二甲胂酸钠，pH 7.2，含有6mM MgCl2）。注意：对于每个反应（最终体积为 100 μL），加入 89 μL 复性缓冲液。 对于每个反应，将 89 μL 复性缓冲液转移到指定的 1.5 mL 管中，并在放置在化学罩下方的恒温摇床中预热 37 °C。注意：DMS具有剧毒，必须始终保存在化学罩下，直到被还原剂淬灭。 在 10 μL 无核酸酶水 （NFH 2O） 中洗脱 1-10 pmol的 RNA;转移到PCR管中。 在95°C的热循环仪中孵育1分钟以使RNA变性。 立即放在冰块上，以免折叠错误。 将RNA样品加入带有37°C复性缓冲液的指定管中，充分混合，孵育10-20分钟以重新溶解RNA。注意：大多数RNA将以毫秒到秒的顺序折叠，尽管存在例外16。 向 RNA 样品中加入 1 μL 100% （10.5 M） DMS，并在以每分钟 800-1，400 转 （rpm） 振荡的同时孵育 5 分钟。注意：此步骤中的摇晃（或其他混合方式）至关重要，因为DMS是疏水性的，可能无法完全溶解在复性缓冲液中。反应时间的偏差可能会影响DMS反应性的重现性。为了最大限度地减少移液误差，如果DMS的终浓度保持在1%（105 mM）的浓度，则可以在将其添加到样品中之前将其溶解在100%乙醇中。对于未经处理的对照，DMS可以用二甲基亚砜（DMSO）或水代替。 反应时间 5 分钟后，用 60 μL 100% β-巯基乙醇 （BME） 淬灭，充分混合，并立即将 RNA 置于冰上。注意：用BME淬灭反应以清理后，可以安全地将RNA从引擎盖中取出。然而，由于其强烈的气味和刺激性，仍应避免将BME直接暴露于周围环境中。 通过乙酸钠-乙醇沉淀（参见步骤2.5）或基于柱的方法（参见步骤2.6）纯化RNA，并在10μL水中洗脱。 使用分光光度计定量RNA。 直接使用将修饰的RNA储存在-80°C。注意：应避免长期储存，因为DMS处理后RNA不太稳定。 修饰RNA的基因特异性RT-PCR检测注意：有关DMS处理片段的RT-PCR设置，请参见 图1 。在 10 μL 无核酸酶 （NF） H2O 中洗脱 100 ng 修饰的 RNA。 转移到 PCR 管中。 向试管中加入 4 μL 5x 第一链缓冲液 （FSB）、1 μL dNTP 混合物（每个 10 mM）、1 μL 0.1 M 二硫苏糖醇 （DTT）（避免冻融循环）、1 μL RNase 抑制剂、1 μL 10 μM 反向引物（单引物或引物池）和 1 μL TGIRT III。注意：对于一组引物，请勿将 1 μL 的 10 μM 每种引物直接添加到室温中;相反，先混合引物，并从混合物中加入 1 μL（总引物浓度为 10 μM）。 在热循环仪中在57°C孵育30分钟至1.5小时（通常，30分钟足以制成500nt产物）。 加入 1 μL 4 M NaOH，通过移液混合，并在 95 °C 下孵育 3 分钟以降解 RNA。注意：此步骤至关重要，因为它通过降解RNA从cDNA中释放TGIRT。如果跳过，下游PCR可能会受到影响。 使用基于色谱柱的方法（参见步骤2.6）进行净化，充分去除引物，并在10 μL NFH 2O中洗脱。 PCR扩增cDNA，方法是使用旨在平衡产量和保真度的PCR试剂盒，每25 μL反应使用1 μL逆转录产物。注意：引物的熔解温度应为~60°C。 在琼脂糖凝胶或预制琼脂糖凝胶上运行 2 μL PCR 产物以验证 PCR 成功。 理想情况下，PCR 后只应显示一个条带。如果是这样，请使用基于柱的方法清理反应。如果存在替代条带，请使用剩余的PCR反应从凝胶中切除正确的条带。以足够小的体积（例如 10 μL）洗脱。 使用分光光度计定量提取的片段。 使用适合所需测序平台的方法对dsDNA片段进行索引以进行测序。 图 1：大型 DMS 处理片段的 RT-PCR 实验装置。 当对修饰的RNA进行逆转录时，不会记录引物退火序列上的修饰。因此，当片段长度超过400-500 bp时，需要设计在引物区域中重叠的片段，如此处的示例所示。片段的长度取决于测序需求。当使用配对末端150循环测序时，片段不应超过300 bp。缩写：RT-PCR = 逆转录聚合酶链反应;DMS = 硫酸二甲酯。 请点击此处查看此图的大图。 2. 使用病毒感染细胞的全基因组DMS-MaP 注意：在细胞中，DMS处理也可以与上述基因特异性扩增方法结合使用。全基因组文库需要巨大的测序深度才能实现对单个基因的完全覆盖。然而，如果病毒RNA在提取后占核糖耗尽RNA的很大一部分，则全基因组测序将是合适的。此外，其他富集方法可以与全基因组文库生成方法结合使用。 糖尿病治疗培养感染病毒的细胞，直到所需的感染阶段。 将细胞容器转移到专用通风橱中，该通风橱适用于处理所需生物安全水平的病毒和DMS等试剂产生的化学烟雾。 向培养基中加入2.5%体积的DMS，并用封口膜密封容器（通常为10厘米板）。注意：使用 DMS 很容易修改不足和过度修改。将DMS直接添加到细胞中时，充分混合非常重要。或者，将新培养基预热在37°C的50mL锥形管中，并直接剧烈摇动加入DMS。将用过的培养基倒在细胞上，然后在含有DMS的培养基中缓慢移液。 转移到37°C培养箱中5分钟。注意：根据在培养箱外处理DMS所需的时间，5分钟可能会导致过度修饰。保持从加入DMS到孵育的时间≤1分钟。如果是第一次进行实验，建议进行DMS滴定并改变孵育时间（3分钟至10分钟之间），以找到最佳修饰率，并确保结果在浓度窗口内具有稳定性。 小心地移出含DMS的培养基（到适当的化学废物中），并轻轻加入10 mL终止缓冲液（含30%BME的PBS [例如，3 mL BME和7 mL PBS]）。注意：如果细胞没有强烈粘附，则添加DMS和BME可以将细胞从平板中取出。如果细胞正在提升，则可以将它们视为悬浮细胞 – 而不是去除含有DMS的培养基，直接添加终止缓冲液，并将带有DMS和BME的细胞刮出到50 mL锥形管中。通过以3，000× g离心3分钟来沉淀细胞;确保去除任何残留的DMS，这些DMS可以在细胞下沉淀成大液滴。如果最初无法去除DMS培养基，建议在30%BME中进行额外的洗涤步骤。 刮取细胞，并将其转移到 15 mL 锥形管中。 通过以3，000 ×g 离心3分钟来沉淀。 除去上清液并用 10 mL PBS 洗涤 2 次。 小心地去除尽可能多的残留PBS。 将沉淀溶解在适量的RNA分离试剂中（例如，T75培养瓶为3 mL，10 cm板为1 mL）。注意：试剂量不足可能会影响RNA产量。 RNA提取和核糖体RNA（rRNA）去除向 RNA 分离试剂中的 1 mL 匀浆细胞中加入 200 μL 氯仿，涡旋 15-20 秒直至亮粉红色，然后孵育长达 3 分钟直至可见相分离。注意：粉红色脂质相应稳定在底部。如果不是这种情况，涡旋时间可能不足。 在4°C下以最大速度（~20，000× g）旋转15分钟。 将上层水相转移到新管中。 通过乙酸钠 – 乙醇沉淀（参见步骤2.5）或基于柱的方法（参见步骤2.6）纯化RNA，并在足够体积的NF H2O中洗脱。 检查琼脂糖凝胶上的RNA完整性。寻找对应于两个核糖体亚基的两个条带。 使用首选方法去除rRNA，并在足够体积（通常为20-50μL）的NFH 2O中洗脱。注意：对于下游应用，建议在 8 μL 的体积中加入 ~500 ng 的总 RNA。 非核糖体 RNA 通常仅占总 RNA 的 5%-10%。 使用分光光度计进行定量。 库生成使用基因特异性 RT-PCR 或其他方法生成文库15.如果使用随机六聚体进行底漆，请在低 Tm （37-42 °C） 下添加孵育步骤以允许六聚体退火。注意：标准文库生成试剂盒也可以通过用TGIRT替换RT酶并将RT温度更改为57°C来使用。 使用RNA Clean & Concentrator色谱柱进行基于色谱柱的RNA净化注意：所有步骤都应在室温下进行。向样品管中加入 NF H2O，使其体积达到 50 μL。 向样品中加入 100 μL 结合缓冲液和 150 μL 100% 乙醇。 混合并转移到离心柱中。 以 10，000-16，000 × g 旋转 30 秒;丢弃流出。 加入 400 μL RNA 制备缓冲液。 以 10，000-16，000 × g 旋转 30 秒;丢弃流出。 加入 700 μL RNA 洗涤缓冲液。 以 10，000-16，000 × g 旋转 30 秒;丢弃流出。 加入 400 μL RNA 洗涤缓冲液。 以 10，000-16，000 × g 旋转 30 秒;丢弃流出。 （可选）将色谱柱转移到新的收集管中，并以10，000-16，000× g 旋转2分钟。 将色谱柱转移到干净的无RNA酶管中，并加入适量的NF H2O。 以 10，000-16，000 × g 旋转 1 分钟。 酸性苯酚-氯仿RNA提取。加入等体积的酸性苯酚：氯仿：异戊醇。 彻底涡旋，并以14，000× g 离心5分钟。 如果没有相分离，则加入 20 μL 2 M NaCl，然后重复离心。 将水相转移到新管中。 加入 500 μL 异丙醇和 2 μL 助沉淀剂。 混合并在室温下孵育3分钟;然后，在-80°C孵育过夜。 通过在4°C下以最大速度（~20，000× g）离心30分钟来沉淀RNA。 用 200 μL 冰冷的 70% 乙醇洗涤沉淀。 以最大速度（~20，000 × g）旋转5分钟;丢弃流出。 将沉淀重悬于适量的NF H2O中。 使用寡核苷酸清洁柱和浓缩器柱进行基于色谱柱的cDNA纯化注意：所有步骤都应在室温下进行。向样品管中加入 NF H2O，使其体积达到 50 μL。 加入 100 μL 结合缓冲液和 400 μL 100% 乙醇。 混合并转移到离心柱中。 以 10，000-16，000 × g 旋转 30 秒;丢弃流出。 加入 750 μL DNA 洗涤缓冲液。 以 10，000-16，000 × g 旋转 30 秒;丢弃流出。 （可选）将色谱柱转移到新的收集管中，并以10，000-16，000× g 旋转2分钟。 将色谱柱转移到干净的无RNA酶管中，并加入适量的NF H2O。 以 10，000-16，000 × g 旋转 1 分钟。 3. 测序数据分析 注意：要从DMS-MaP测序数据创建RNA二级结构模型，必须通过几个不同的步骤处理生成的.fastq文件。这些步骤可以使用 使用 TrimGalore 或 Cutadapt 修剪适配器序列。 使用 Bowtie2 将读取映射到参考序列（.fasta 格式）。 使用专门的 RNA 结构软件（例如 DREEM14、RNA-Framework17 或类似软件）对读数进行计数，并创建反应性图谱。 （可选）聚类读取以使用DREEM14，DRACO 17，DANCE-MaP18或类似物找到替代RNA构象。 使用RNAStructure12，ViennaRNA或类似方法根据反应性曲线预测最小自由能结构。 使用VARNA（https://varna.lri.fr/）或类似方法可视化RNA11 结构。注意：为了实用性，DREEM （www.rnadreem.org） 和 RNA-Framework19 等软件在其管道中大量包含步骤 1–5，从而简化了分析过程。然而，任何结构预测都应该小心处理（例如，通过验证结构与数据的一致性20。