Studying Habituation in <em>Stentor coeruleus</em>

Deepa Rajan; Peter Chudinov; Wallace Marshall

doi:10.3791/64692

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biyoloji

Étude de l’accoutumance chez Stentor coeruleus

Published: January 06, 2023

doi:

10.3791/64692

Deepa Rajan¹, Peter Chudinov¹, Wallace Marshall¹

¹Department of Biochemistry and Biophysics,University of California San Francisco

Özet

Nous introduisons une méthode pour quantifier l’accoutumance de Stentor à l’aide d’un appareil relié à une carte de microcontrôleur qui peut délivrer des impulsions mécaniques à une force et une fréquence spécifiées. Nous incluons également des méthodes pour assembler l’appareil et mettre en place l’expérience de manière à minimiser les perturbations externes.

Abstract

L’apprentissage est généralement associé à un système nerveux complexe, mais il est de plus en plus évident que la vie à tous les niveaux, jusqu’aux cellules individuelles, peut afficher des comportements intelligents. Dans les systèmes naturels et artificiels, l’apprentissage est la mise à jour adaptative des paramètres du système basée sur de nouvelles informations, et l’intelligence est une mesure du processus informatique qui facilite l’apprentissage. Stentor coeruleus est un organisme unicellulaire vivant dans un étang qui présente une accoutumance, une forme d’apprentissage dans laquelle une réponse comportementale diminue à la suite d’un stimulus répété. Le stentor se contracte en réponse à une stimulation mécanique, qui est une réaction apparente d’évasion des prédateurs aquatiques. Cependant, des perturbations répétées de faible force induisent une accoutumance, démontrée par une réduction progressive de la probabilité de contraction. Ici, nous introduisons une méthode pour quantifier l’accoutumance de Stentor à l’aide d’un appareil relié à une carte de microcontrôleur qui peut délivrer des impulsions mécaniques à une force et une fréquence spécifiées, y compris des méthodes pour construire l’appareil et configurer l’expérience de manière à minimiser les perturbations externes. Contrairement aux approches décrites précédemment pour stimuler mécaniquement Stentor, ce dispositif permet de faire varier la force de stimulation sous contrôle informatique au cours d’une seule expérience, augmentant ainsi considérablement la variété des séquences d’entrée qui peuvent être appliquées. Comprendre l’accoutumance au niveau d’une seule cellule aidera à caractériser les paradigmes d’apprentissage indépendants des circuits complexes.

Introduction

L’apprentissage est généralement associé à un système nerveux complexe, mais il est de plus en plus évident que la vie à tous les niveaux, jusqu’aux cellules individuelles, peut afficher des comportements intelligents. Dans les systèmes naturels et artificiels, l’apprentissage est la mise à jour adaptative des paramètres du système en fonction de nouvelles informations¹, et l’intelligence est une mesure du processus informatique qui facilite l’apprentissage².

Stentor coeruleus est un organisme unicellulaire vivant dans un étang qui présente une accoutumance, une forme d’apprentissage dans laquelle une réponse comportementale diminue suite à un stimulus répété³. Stentor se contracte en réponse à la stimulation mécanique³, qui est une réaction apparente d’évasion des prédateurs aquatiques. Cependant, des perturbations répétées de faible force induisent une accoutumance, démontrée par une réduction progressive de la probabilité de contraction³. Le Stentor habitué se contracte encore après avoir reçu une stimulation mécanique à force élevée⁴ ou une stimulation photique⁵. Ces observations, qui s’alignent sur les critères classiques de Thompson et Spencer pour l’accoutumance chez les animaux⁶, suggèrent fortement que la diminution initiale de la réponse contractile est due à l’apprentissage plutôt qu’à la fatigue ou à l’épuisement de l’ATP. En tant que cellule libre, Stentor peut être étudié sans trop d’interférence des cellules environnantes, comme ce serait le cas dans un tissu multicellulaire. Plusieurs caractéristiques supplémentaires font de Stentor un système traitable pour étudier l’apprentissage : sa grande taille (1 mm), sa réponse d’accoutumance quantifiable³, la facilité d’injection et de micromanipulation⁷, le^{génome 8} entièrement séquencé et la disponibilité d’outils d’interférence ARN (ARNi)⁹. L’utilisation de cet organisme modèle pour explorer l’apprentissage cellulaire sans cerveau ni système nerveux nécessite une procédure reproductible pour stimuler les cellules de Stentor et mesurer la réponse.

Ici, nous introduisons une méthode pour quantifier l’accoutumance de Stentor à l’aide d’un appareil relié à une carte de microcontrôleur qui peut délivrer des impulsions mécaniques à une force et une fréquence spécifiées, y compris des méthodes pour construire l’appareil et configurer l’expérience de manière à minimiser les perturbations externes (Figure 1). Comprendre l’accoutumance au niveau d’une seule cellule aidera à caractériser les paradigmes d’apprentissage indépendants des circuits complexes.

Figure 1 : Configuration de l’expérience d’accoutumance. La plaque de Petri contenant Stentor est placée sur la règle métallique flexible du dispositif d’habituation. L’armature du dispositif d’accoutumance frappe alors la règle métallique à une force et une fréquence spécifiées, produisant une onde de stimulus à travers le champ des cellules. La caméra du microscope USB enregistre les réponses du Stentor à la stimulation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Résumé du flux de travail de l’expérience d’habituation. La figure montre les étapes de base de l’étude de Stentor à l’aide du dispositif d’habituation. La figure a été créée avec BioRender.com. Adapté de « Process Flowchart », par BioRender.com (2022). Extrait de https://app.biorender.com/biorender-templates. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

REMARQUE : Un résumé du flux de travail de l’expérience d’accoutumance est illustré à la figure 2. 1. Assemblage du dispositif d’accoutumance Connectez le pilote du moteur au moteur (voir Figure 3).Connectez les deux fils étiquetés A de la carte pilote aux fils bleu et rouge du moteur. Connectez les deux fils étiquetés B de la carte pilote aux fils verts et noirs du moteur.REMARQUE: En regardant vers le bas sur la carte pilote d’en haut avec les fils du moteur en haut, les quatre fils d’entrée doivent se connecter aux fils du moteur dans cet ordre: bleu, rouge, noir et vert. Construisez le circuit de la breadboard illustré à la Figure 4, en prenant un soin particulier pour connecter les LED dans la polarité correcte. Connectez le Vcc (+5 V) de la carte pilote au rail supérieur de la breadboard blanche et le Gnd de la carte driver au rail inférieur de la breadboard. Connectez la masse de la breadboard à la broche de terre de la carte microcontrôleur. Connectez respectivement les fils LED verte, rouge, interrupteur et bouton aux broches numériques 8, 9, 10 et 11 de la carte du microcontrôleur. Connectez les broches numériques 2 et 3 de la carte du microcontrôleur aux fils de la carte pilote Step et Dir. Connectez les broches numériques 4, 5, 6 et 7 de la carte du microcontrôleur aux fils de la carte pilote.Connectez la broche 4 au MS1, connectez la broche 5 au MS2, connectez la broche 6 au MS3 et connectez la broche 7 à l’option Activer. Alimentez la carte pilote avec une alimentation de 12 V. Branchez l’alimentation 12 V dans la fiche adaptateur noir/vert reliée par deux fils rouges à la carte pilote du moteur.REMARQUE: Ne branchez pas l’alimentation 12 V dans la fiche de la carte du microcontrôleur. Téléchargez le programme de contrôle (https://github.com/WallaceMarshallUCSF/StentorHabituation/blob/main/stentor_habituator_stepper_v7.ino) sur la carte du microcontrôleur. Utilisez un câble USB pour connecter la carte du microcontrôleur à un ordinateur, qui servira également de source d’alimentation pour la carte du microcontrôleur. Vérifiez que les contrôles utilisateur fonctionnent.Vérifiez que le commutateur à glissière active et désactive le mode automatique. En mode automatique, le système effectuera un pas à intervalles réguliers spécifiés par l’utilisateur (voir ci-dessous). Vérifiez que le voyant vert s’allume lorsque le mode automatique est activé. Vérifiez que la LED rouge clignote 1 s avant que le moteur n’applique une impulsion. La LED rouge est un voyant d’avertissement qui indique quand le système est sur le point de délivrer une impulsion mécanique. Testez le bouton rouge, qui déclenche un micro-pas 1/16 chaque fois que vous appuyez sur le bouton, que le système soit en mode automatique ou non. Figure 3 : Composants du dispositif d’accoutumance. Toute l’électronique étiquetée est nécessaire pour assembler la machine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Schéma électronique. C’est le circuit sur la planche à pain. Les fils connectés à la carte microcontrôleur sont numérotés comme décrit dans le protocole. D1 et D2 sont les LED rouges et vertes, respectivement, et sont connectées à la terre par des résistances de 330 Ω. Les deux interrupteurs sont tirés vers le haut avec des résistances 10 KΩ. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. 2. Mise en place de l’expérience d’accoutumance Procurez-vous Stentor. Enduire une plaque de 35 mm d’une solution de polyornithine à 0,01 %.Ajouter 3 mL de la solution de polyornithine à 0,01 % dans la plaque et laisser reposer toute la nuit. Lavez l’assiette deux fois avec de l’eau ultrapure et une fois avec de l’eau de source pasteurisée (PSW) (Tableau des matériaux). Ajouter 3,5 mL de PSW à la plaque de 35 mm. Lavez le Stentor dans une assiette à 6 puits (table des matériaux).Ajouter 3 mL de PSW au premier puits et 5 mL de PSW aux deuxième et troisième puits. Utilisez une pipette P1,000 pour ajouter 2 ml de Stentor d’une boîte de culture au premier puits de la plaque de 6 puits. Identifier chaque Stentor à l’aide d’un stéréomicroscope (Table des matériaux), puis utiliser une pipette P20 pour transférer 100 Stentor du premier puits au deuxième. Identifiez chaque Stentor à l’aide d’un stéréomicroscope, puis utilisez une pipette P20 pour transférer 100 Stentor du deuxième puits au troisième puits. Utiliser une pipette P200 pour transférer 100 Stentor dans un volume total de 500 μL du troisième puits de la plaque à 6 puits dans la plaque de 35 mm de sorte que le volume final dans la plaque de 35 mm soit de 4 mL. Collez un morceau (7 cm x 7 cm) de papier blanc sur la règle métallique du dispositif d’accoutumance. Assurez-vous que le bord gauche du papier se trouve à 2 cm de l’extrémité de la règle la plus proche de l’armature. Utilisez du ruban adhésif double face pour coller le bas de la plaque de 35 mm au centre du papier 2 po x 2 po sur le dessus de la règle du dispositif d’accoutumance. Laissez la plaque de 35 mm sur l’appareil d’accoutumance pendant au moins 2 h (cela peut être prolongé jusqu’à la nuit) avec le couvercle fermé. Tout au long de cette période d’acclimatation, conserver la plaque dans des conditions de lumière ambiante qui correspondent aux conditions de lumière expérimentales (c.-à-d. ne pas soumettre les cellules à des fluctuations lumière/obscurité). De plus, assurez-vous que la plaque ne subit aucune perturbation mécanique due à une bousculade accidentelle. Centrez la caméra du microscope USB (Table of Materials) directement au-dessus de la plaque de 35 mm de Stentor. Si nécessaire, placez un accessoire tel qu’une boîte d’embout de pipette sous la caméra de microscope USB (Universal Serial Bus) pour ajuster la hauteur. Alternativement, un support d’anneau peut être utilisé pour ajuster la hauteur. Installez l’application d’enregistrement Webcam sur un ordinateur portable (Table of Materials) et utilisez-la pour visualiser les cellules via l’entrée du microscope.Ouvrez l’application Webcam recorder et sélectionnez le microscope USB dans le menu déroulant. Ajustez la mise au point sur la caméra du microscope USB afin que les cellules soient clairement visibles. Ajustez la position de la caméra du microscope USB pour maximiser le nombre de cellules dans le champ de vision. Ouvrez le moniteur série de la carte microcontrôleur : sélectionnez No Line Ending (Aucune fin de ligne ) et réglez-le sur 9 600 bauds. Utilisez la commande l sur le programme de carte de microcontrôleur pour abaisser l’armature jusqu’à ce qu’elle touche à peine la règle. Utilisez la commande r pour lever le bras si nécessaire pour ajuster la position exacte.REMARQUE: Si l’induit est à une distance significative de la règle, tapez la commande d pour désactiver le courant de bobine du moteur afin que le bras puisse être déplacé manuellement vers la règle. Après avoir déplacé le bras manuellement, utilisez la commande e pour activer le courant de bobine du moteur et maintenir le bras verrouillé en position. Lorsqu’elle est correctement abaissée avant le début d’une expérience, l’extrémité inférieure de l’armature doit être à 1 cm du bord gauche de la règle. L’induit délivrera l’impulsion mécanique en frappant la règle. Utilisez la commande i pour initialiser le mode automatique sur l’appareil d’habituation. Entrez la taille de l’étape dans la ligne de commande. Le niveau 5 est la plus petite étape, et le niveau 1 est la plus grande étape. Le niveau 4 est la taille des pas utilisée pour les expériences d’habituation de base.REMARQUE: Un stimulus de niveau 5 entraîne un déplacement vers le bas de la règle de ~0,5 mm; Le niveau 4 entraîne un déplacement vers le bas de ~1 mm; Le niveau 3 entraîne un déplacement vers le bas de ~2 mm; Le niveau 2 entraîne un déplacement vers le bas de ~3-4 mm; et le niveau 1 entraîne un déplacement vers le bas de ~8 mm. Un stimulus de niveau 5 entraîne une force maximale descendante de l’armature contre la règle de ~0,122 N; Le niveau 4 entraîne une force de crête descendante de ~0,288 N; et le niveau 3 entraîne une force maximale descendante de ~0,557 N. Les forces descendantes générées par les niveaux 1 et 2 sont plus difficiles à quantifier empiriquement avec un dynamomètre en raison des oscillations importantes de la règle qui se produisent après le contact de l’induit. Entrez le temps entre les impulsions en minutes. L’intervalle utilisé pour les expériences d’habituation de base est de 1 min. Commencez à prendre une vidéo à l’aide de l’application Webcam Recorder en appuyant sur le bouton d’enregistrement rouge. Ensuite, actionnez l’interrupteur de l’appareil d’accoutumance pour commencer l’expérience avec la première livraison mécanique automatisée d’impulsions. 3. Analyse de la vidéo d’expérience Immédiatement avant que la première impulsion mécanique n’apparaisse sur la vidéo, faites une pause et comptez le nombre de Stentor qui sont ancrés au bas de la plaque de 35 mm et étendus dans une forme allongée en forme de trompette (Figure 5A, Vidéo 1). Immédiatement après la première impulsion, comptez le nombre de Stentor qui sont ancrés au fond de la plaque et contractés en forme de boule (Figure 5B, Vidéo 1).REMARQUE: Les cellules contractées sont facilement discernables des cellules allongées parce que Stentor raccourcit la longueur de leur corps de plus de 50% en 10 ms lors d’un événement de contraction3. Divisez le deuxième comptage par le premier comptage pour déterminer la fraction de Stentor qui s’est contractée en réponse au stimulus mécanique. Répétez les étapes 3.1 à 3.3 pour toutes les impulsions mécaniques de la vidéo d’expérience. Figure 5 : Le stentor se contracte après avoir reçu un stimulus mécanique. (A) Les Stentor sont dans leur état allongé et ancrés au fond de la plaque de Petri. (B) Le Stentor s’est contracté après avoir reçu une stimulation mécanique de niveau 4 du dispositif d’habituation. Les images ont été prises avec un microscope USB. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Vidéo 1 : Vidéo de la passation de contrats avec Stentor. Le Stentor reçoit un stimulus mécanique de niveau 4 du dispositif d’accoutumance toutes les minutes. Ces cellules ne se sont pas encore habituées, elles se contractent donc après avoir reçu le pouls. Les cellules sont dans la plaque de Petri placée au-dessus du dispositif d’accoutumance. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Representative Results

La méthode décrite ci-dessus, utilisant l’impulsion mécanique de niveau 4 à une fréquence de 1 tap/min, devrait entraîner une réduction progressive de la probabilité de contraction du Stentor en 1 h. Cela indique une accoutumance (voir Figure 6, Vidéo 2). Figure 6 : Habituation de base. La probabilité de contraction de Stentor diminue progressivement au cours de 1 heure après avoir reçu des impulsions mécaniques de niveau 4 à une fréquence de 1 tapotement/min (n = 22-27). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Vidéo 2. Vidéo de Stentor habitué. Les cellules reçoivent un stimulus mécanique de niveau 4 après 1 h de réception d’impulsions mécaniques de la même force à une fréquence de 1 tap/min. La plupart des cellules se sont habituées aux stimuli pendant l’heure et, par conséquent, ne se contractent pas. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo. La modification de la force et/ou de la fréquence de l’émission d’impulsions mécaniques peut modifier la dynamique d’accoutumance de Stentor . Par exemple, l’utilisation de l’impulsion de niveau 2 à une fréquence de 1 tapotement/min empêche l’accoutumance au cours de 1 h (voir la figure 7). Une impulsion de niveau 5 devrait provoquer des contractions chez quelques Stentor ou zéro. Figure 7 : Absence d’accoutumance dans les 1 h pour des forces plus fortes. La probabilité de contraction de Stentor ne diminue pas sensiblement au cours de 1 h après avoir reçu des impulsions mécaniques de niveau 2 à une fréquence de 1 tapotement/min (n = 7-33). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les étapes les plus critiques du protocole consistent à s’assurer que le Stentor reste dans des conditions optimales pour que des contractions se produisent. La réponse de contraction dans le test d’accoutumance exige que les Stentors soient ancrés à une surface à l’aide de leur tenue collante, car ils se contractent rarement lorsqu’ils nagent librement. Cependant, la surface inférieure de la plaque de Petri de 35 mm utilisée pour les expériences d’accoutumance n’est généralement pas propice à l’ancrage à moins d’être recouverte de poly-ornithine. De plus, le Stentor ne peut être exposé à aucune perturbation mécanique pendant au moins 2 h avant le début de l’expérience d’accoutumance car l’échelle de temps d’oubli du Stentor est de 2 à 6 h³. Si Stentor reçoit une stimulation mécanique dans les 2 heures suivant l’heure de début de l’expérience d’habituation, il est possible que cette stimulation préalable induise un léger niveau d’accoutumance avant l’expérience, réduisant ainsi la probabilité de contraction après que le dispositif d’habituation ait émis la première impulsion mécanique. Enfin, au cours de l’étape de l’analyse, il est important de ne compter que le nombre de Stentor qui se contractent après une impulsion – plutôt que les contractions spontanées fortuites qui se produisent avant la livraison de l’impulsion – afin d’obtenir une lecture précise de la fraction de cellules qui se sont contractées en réponse à la stimulation mécanique.

Le protocole peut être facilement modifié pour étudier différents types de dynamique d’accoutumance en changeant la force et la fréquence des impulsions mécaniques délivrées par le dispositif d’accoutumance. Cela donne également l’occasion d’explorer d’autres types d’apprentissage, tels que la sensibilisation, qui pourraient se produire à Stentor. Le code de programme de la carte microcontrôleur lui-même peut également être ajusté pour fournir différents modèles de robinets mécaniques au Stentor.

Un problème potentiel à résoudre avec ce protocole est la faible fréquence d’ancrage de Stentor , ce qui pourrait limiter le nombre de Stentor pouvant être observé dans l’expérience d’habituation. La fréquence d’ancrage est parfois réduite dans les cultures de Stentor qui n’ont pas été nourries récemment ou qui sont contaminées. Pour résoudre ce problème, il faut laver un nouveau lot de Stentor pour commencer une nouvelle culture et les nourrir régulièrement selon le protocole décrit dans Lin et ^al.10.

Ce protocole est limité en ce sens qu’une seule plaque de Stentor peut être testée à la fois, ce qui donne des mesures à débit relativement faible. De plus, les logiciels actuels ne permettent pas l’automatisation de l’analyse d’images à cellule unique. La plupart des données acquises sont donc au niveau de la population. Les futurs modèles du dispositif d’accoutumance et les outils d’analyse d’images pourraient faciliter les expériences monocellulaires à haut débit.

L’accoutumance chez Stentor a déjà été étudiée à l’aide de méthodes décrites par Wood³, mais ce nouveau protocole permet d’automatiser les expériences. L’automatisation permet non seulement au chercheur de délivrer de manière reproductible des impulsions mécaniques d’une force et d’une fréquence spécifiées, mais facilite également les expériences d’accoutumance à long terme puisque l’appareil peut être laissé en marche sans supervision pendant des jours. De plus, l’utilisation d’un moteur pas à pas plutôt que du solénoïde employé dans les expériences de Wood³ réduit le risque de démagnétisation au fil du temps et permet également de faire varier la force du stimulus au cours d’une seule expérience.

L’étude de l’accoutumance cellulaire peut révéler des connaissances cliniques pour des conditions telles que le trouble déficitaire de l’attention / hyperactivité (TDAH) et le syndrome de Gilles de la Tourette dans lequel l’accoutumance est altérée¹¹. Les mécanismes d’habituation du stentor peuvent également dévoiler de nouveaux paradigmes d’apprentissage non synaptiques indépendants des circuits cellulaires complexes. Enfin, les connaissances sur l’apprentissage unicellulaire pourraient inspirer des méthodes de reprogrammation des cellules dans les tissus multicellulaires – une autre avenue potentielle pour lutter contre la maladie.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Tatyana Makushok pour les innombrables discussions sur l’apprentissage de Stentor . Ce travail a été financé par la subvention NSF MCB-2012647 et par la subvention R35 GM130327 des NIH, ainsi que par le prix I2CELL de la Fondation Fourmentin-Guilbert.

Materials

0.01% Poly-ornithine	Millipore Sigma	P4957	Used to coat Petri plate
35-mm Petri plate	Benz Microscope Optics Center Inc.	L331	Contains Stentor during experiments
6-well plate	StemCell Technologies	38016	Used to wash Stentor
Aluminum breadboard, 4" x 24" x 1/2" (x1)	Thorlabs	MB424	Used to construct habituation device
Big easy driver stepper motor driver board (x1)	Sparkfun	ROB-12859	Used to construct habituation device
Construction rail, 1" x 5'' (x2)	Newport	Newport CR-1	Used to construct habituation device
Laptop	Apple Store	https://www.apple.com/macbook-air-m1/	Connect laptop to USB microscope to visualize experiments
Large right-angle bracket (x1)	Thorlabs	AP90RL	Used to construct habituation device
Microcontroller board	Arduino	A000066	Used to control habituation device
Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A 84oz.in 48mm 4-Lead	Stepperonline.com	5-17HS19-2004S1	Used to construct habituation device
Pasteurized spring water	Carolina	132458	Media for Stentor experiments
Right-angle bracket (x3)	Thorlabs	AP90	Used to construct habituation device
Stemi 2000 stereo microscope	Zeiss		Used to visualize Stentor during wash steps
Stentor coeruleus	Carolina	131598	These are the cells used for habituation experiments
USB microscope	Celestron	44308	Used to visualize and record experiments
Webcam recorder	Apple Store	https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12	Install this application to take videos of experiments