Mapeo de las interacciones del genoma 3D de los mamíferos con Micro-C-XL

1. Cultivo celular y reticulación Cultivar células de acuerdo a las necesidades experimentales para obtener un mínimo de 1 x 107 células. Aquí, las células se cultivaron a 37 °C con 5% de CO2 en medio E14 (DMEM con piruvato y L-glutamina, 15% FBS, 1x LIF, 1x NEAA, 1% pen-strep, 0,1 mM β-mercaptoetanol [ver Tabla de Materiales]) y se dejaron pasar cada dos días.NOTA: Este protocolo se ha aplicado con éxito a varios tipos de células de múltiples especies, como Homo sapiensy Mus musculus. En este ejemplo, se utilizaron células madre embrionarias (ES) de ratón. Coseche las células al 70%-80% de confluencia aspirando el medio. Lavar una vez con 5 ml de DPBS e incubar las células con 3 ml de tripsina precalentada al 0,25% por plato de 10 cm durante 2-3 min a 37 °C. Apague la tripsina con 7 ml de medio E14 precalentado y transfiera las células desprendidas a un tubo de 50 ml. Granular las células por centrifugación a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo celular en el medio. Cuente las celdas con un contador de celdas.NOTA El protocolo es robusto a algunas variaciones en las concentraciones celulares, y se han utilizado varios contadores celulares para cuantificar el número de células; Sin embargo, tenga en cuenta el rango dinámico del contador de celdas utilizado. Por lo general, esto está entre 1 x 105-1 x 107 células/ml. Si bien la velocidad y la duración de la centrifugación se han probado para este tipo de celda, las celdas diferentes y más pequeñas pueden requerir una velocidad de centrifugación más alta o tiempos de centrifugado más largos, y la centrifugación debe ajustarse en consecuencia. Recoger las células por centrifugación a 300 x g durante 5 min a RT y resuspender las células en DPBS a una concentración final de 1 x 106 células/mL. Por ejemplo, si el rendimiento es de 1 x 107 células, vuelva a suspender las células en 10 ml de DPBS. Para el primer paso de reticulación, agregue un 37% de formaldehído (FA) a una concentración final del 1% a la suspensión celular e incube la suspensión celular durante 10 min a RT con rotación (15-20 rpm); por ejemplo, si el rendimiento es de 1 x 107 células, agregue 270 μL de AG a la suspensión celular de 10 mL.NOTA: La solución FA suele ser estable en RT hasta 3 meses después de la apertura. Apagar la reacción añadiendo 2,5 M de glicina a una concentración final de 0,25 M e incubar durante 5 min a RT con rotación (15-20 rpm). Por ejemplo, si el rendimiento es de 1 x 107 células, agregue 1,027 ml de glicina 2,5 M a la suspensión celular. Recoja las células por centrifugación a 300 x g durante 5 min en RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 5 mL de DPBS. Repita el paso de centrifugación una vez y vuelva a suspender las células peletizadas en DPBS a 4 x 106 células/ml. Por ejemplo, si el rendimiento es de 1 x 107 células, vuelva a suspender las células en 2,5 ml de DPBS. Para el segundo paso de reticulación, prepare una solución madre 0,3 M de succinimidil de etilenglicol bis-succinimidil (EGS) en DMSO (13,6 mg de EGS en 100 μL de DMSO). Añadir EGS a una concentración final de 3 mM a la suspensión celular, e incubar a RT durante 40 min con rotación (15-20 rpm). Por ejemplo, si el rendimiento es de 1 x 107 células, añadir 25 μL de solución madre de 0,3 M de EGS a 2,5 mL de la suspensión celular.NOTA: Equilibre el EGS a RT durante al menos 20 minutos antes de pesar para preparar la solución madre. Apagar la reacción añadiendo 2,5 M de glicina a una concentración final de 0,4 M, e incubar durante 5 min a RT con rotación (15-20 rpm). Por ejemplo, si el rendimiento es de 1 x 107 células, agregue 400 μL de glicina 2,5 M a la suspensión celular. Recoja las células por centrifugación a 1.000 x g durante 5 min a RT y vuelva a suspender las células peletizadas en DPBS a 5 x 106 células/mL. Distribuya 5 x 10 6 células/tubo para bibliotecas preparativas y 1 x 106 células/tubo para la valoración para la digestión de la MNasa.NOTA: Se sugiere valorar el grado óptimo de digestión para cada lote de células reticuladas. Idealmente, recolectar de dos a tres alícuotas de 1 x 10 6 células para los experimentos de valoración de MNasa (paso 2) y de dos a cuatro alícuotas de 5 x 106 células para los experimentos preparativos (paso 3). Recoger las células por centrifugación a 1.000 x g durante 5 min a RT y eliminar el sobrenadante. Congele rápidamente los gránulos de celda en nitrógeno líquido y guárdelos a -80 °C.NOTA: Las bibliotecas Micro-C exitosas se pueden preparar a partir de muestras almacenadas durante un máximo de 3 meses. 2. Valoración de MNasa NOTA: Es necesario realizar una valoración de MNasa para determinar la concentración óptima de MNasa antes de procesar la biblioteca preparativa de las células doblemente reticuladas. Para realizar la valoración de MNasa, descongele un gránulo de 1 x 106 células en hielo durante 10 min y vuelva a suspender las células en 500 μL de DPBS (añadir 1x BSA si las células se adhieren a la pared). Incubar la suspensión celular en hielo durante 20 min. Recoger las células por centrifugación a 10.000 x g durante 5 min a RT, y eliminar el sobrenadante. Resuspender las células peletizadas en 500 μL de tampón MB#1 (50 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, 5 mM de MgCl2, 1 mM de CaCl 2,0,2% de NP-40, 1x inhibidor de la proteasa [ver Tabla de Materiales], pH 7.4). Recoger las células por centrifugación a 10.000 x g durante 5 min, y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 200 μL de tampón MB#1 y divida la muestra en cuatro tubos. Descongele un vial de MNasa (20 U/μL) y diluya con 10 mM de Tris, pH 7,4, en una serie de 1:2, 1:4, 1:4 y 1:4 para alcanzar concentraciones de 10 U/μL, 2,5 U/μL, 0,625 U/μL y 0,1256 U/μL respectivamente (una para cada condición de digestión). Con intervalos de tiempo apropiados (10-20 s), añadir 1 μL de solución de MNasa a una de las cuatro muestras, vórtice, e incubar en una termomezcladora a 37 °C durante 10 min (agitación a 800 rpm). Continúe con la adición de 1 μL de las diluciones restantes de MNasa a las alícuotas celulares restantes. Detenga la digestión de la Mnasa añadiendo 200 μL de tampón STOP recién preparado (150 μL de 10 mM de Tris, pH 7,4, 25 μL de SDS al 10 %, 25 μL de 20 mg/ml de proteinasa K, 2 μL de 0,5 M de EGTA) a cada tubo en el mismo orden y con el mismo intervalo de tiempo en que se añadió la MNasa. Incubar a 65 °C durante 2 h. Agregue 500 μL de alcohol fenol-cloroformo-isoamílico (PCI) a cada muestra y mezcle bien mediante vórtice. Centrifugar a 19.800 x g durante 5 min a RT para separar las fases, y transferir la fase acuosa a nuevos tubos (aproximadamente 200 μL/muestra).PRECAUCIÓN: El PCI contiene numerosos componentes tóxicos y solo debe manipularse en una campana de seguridad química. Consulte al fabricante para obtener más detalles. Purifique el ADN utilizando un kit comercial de purificación de ADN (consulte la Tabla de materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y eluya las muestras en 12 μL de tampón de elución.NOTA: La concentración de SDS de la etapa de desproteinización (paso 2.5) es inhibidora para algunos kits de purificación de ADN. El kit de purificación de ADN utilizado aquí tiene un rendimiento comparable al de la precipitación de etanol. Agregue 2-5 μL de colorante de carga y ejecute las muestras en un gel de agarosa al 1,5% a 120 V durante 30-50 min (hasta que se separen correctamente; Figura 1A). Elija el mejor grado de digestión para el experimento y continúe con la digestión preparativa de MNasa. Un grado óptimo de digestión muestra poco o ningún fragmento subnucleosomal y una proporción de mononucleosoma a dinucleosoma del 70 % al 90 %.NOTA: En este experimento, se determinó que el grado de digestión del carril 4 en la Figura 1A es la digestión óptima obtenida con 0,625-1,25 U de Mnase para 2,5 x 10 5 células (= 2,5-5 U de Mnase para 1 x 106 células). Para una discusión detallada, consulte los resultados representativos. 3. Digestión preparativa de la MNasa Para fragmentar la cromatina en los mononucleosomas a través de la digestión de MNasa, descongelar alícuotas de 5 x 106 células previamente reticuladas previamente y resuspender en 1 ml de DPBS. Incubar en hielo durante 20 minutos (añadir 1x BSA si las células se adhieren a la pared del tubo). Recoger las células por centrifugación a 10.000 x g durante 5 min a RT, y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo en 500 μL de tampón MB#1. Repita el paso de centrifugación una vez. Vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de tampón MB#1 y haga 200 μL de alícuotas (1 x 106 células por alícuota). Con base en la valoración de MNasa (descrita en el paso 2), digiera la cromatina agregando la cantidad adecuada de MNasa (generalmente 2,5-10 U/μL por 1 x 106 células) a cada alícuota. Mezclar bien (vórtice y centrifugar rápidamente) e incubar en una termobatidora a 37 °C durante 10 min agitando a 800 rpm. Detenga la digestión de MNasa añadiendo 1,6 μL de 0,5 M EGTA (4 mM finales) a cada alícuota, e incube en una termomezcladora a 65 °C durante 10 min con agitación a 800 rpm. Recoger la muestra por centrifugación a 10.000 x g durante 5 min a RT, y desechar el sobrenadante. Resuspender el gránulo celular en 500 μL de 1x NEBuffer 2.1. Agrupar muestras equivalentes a una entrada de 5 x 106 celdas o menos para su posterior procesamiento.NOTA: Si se van a procesar más de 5 x 10 6 células, procese estas muestras en paralelo, ya que las condiciones enzimáticas están optimizadas para 5 x 106 células. Antes de continuar con los pasos de ligadura de proximidad, transfiera el 10% de la muestra como control de entrada para controlar el nivel de digestión de MNasa. Añadir a esta muestra 150 μL de Tris 10 mM, pH 7,4, 25 μL de SDS al 10% y 25 μL de 20 mg/mL de proteinasa K e incubar durante la noche a 65 °C. 4. Procesamiento de extremos de ADN y ligadura de proximidad Recoger la muestra restante por centrifugación a 10.000 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo en 90 μL de mezcla maestra Micro-C 1 recién preparada (Tabla 1) e incube en una termomezcladora durante 15 min a 37 °C con agitación a 800 rpm. Añadir 10 μL de 5 U/μL de Klenow Fragment e incubar en una termomezcladora durante 15 min a 37 °C agitando a 800 rpm. Añadir 100 μL de mezcla maestra Micro-C 2 recién preparada (Tabla 2) e incubar en una termomezcladora durante 45 min a 25 °C con agitación a 800 rpm. Después de la incubación, apagar la reacción enzimática añadiendo EDTA a una concentración final de 30 mM. Incubar en una termomezcladora durante 20 minutos a 65 °C agitando a 800 rpm. Recoger la muestra por centrifugación a 10.000 x g durante 5 min a 4 °C, y desechar el sobrenadante. Resuspender la muestra en 500 μL de mezcla maestra Micro-C 3 recién preparada (Tabla 3) e incubar durante 2,5 h a RT con rotación (15-20 rpm). Recoger la muestra por centrifugación a 10.000 x g durante 5 min a 4 °C, y desechar el sobrenadante. Volver a suspender la muestra en 200 μL de mezcla maestra Micro-C 4 recién preparada (Tabla 4) e incubar en una termomezcladora durante 15 min a 37 °C con agitación a 800 rpm. Para la reticulación inversa y la desproteinación, añadir 25 μL de 20 mg/ml de proteinasa K y 25 μL de SDS al 10% a la muestra, e incubar a 65 °C durante la noche con mezcla intermitente. 5. Purificación de ADN dinucleosomal y selección de tamaño Agregue 500 μL de PCI a las muestras y al control de entrada, y mezcle por vórtice. Separar las fases por centrifugación a 19.800 x g durante 5 min, y transferir la fase acuosa superior a un tubo nuevo. Concentrar el ADN utilizando un kit de purificación de ADN o mediante precipitación de etanol. Eluir las muestras en 30 μL (paso 5.3) y los controles de entrada (paso 3.11) en 15 μL, y ejecutar un gel de agarosa al 1,5 % para separar los mononucleosomas y dinucleosomas (Figura 1B).NOTA: La concentración de SDS de la etapa de desproteinización es inhibidora para algunos kits de purificación de ADN. El kit de purificación de ADN utilizado aquí (ver Tabla de Materiales) tiene un rendimiento comparable al de la precipitación de etanol. Dependiendo del número de células utilizadas, la entrada puede oscilar entre 100 ng y 10 μg. Normalmente, se extraen de 1 a 5 μg de ADN de 5 x 106 células. Extirpar los fragmentos de ADN que tienen un tamaño dinucleosomal (aproximadamente 300 pb). Utilice un kit de elución de gel de ADN disponible en el mercado (consulte la Tabla de materiales) para extraer el ADN del gel de agarosa y eluir en 150 μL. 6. Preparación de las perlas de estreptavidina Transfiera 10 μL de perlas de estreptavidina (ver Tabla de materiales) por muestra a un tubo de reacción. Colóquelo en un imán apropiado para tubos de 1,5 ml (consulte la tabla de materiales). Después de que la solución se aclare (1-2 min), retire el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas en 300 μL de 1x TBW (5 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M de NaCl, 0,05% Tween 20) por muestra. Repita este paso una vez. Vuelva a suspender las perlas en 150 μL de tampón 2x B&W (10 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M de NaCl) por muestra procesada en el paso 7. 7. Preparación de la biblioteca desplegable y en el cordón de estreptavidina Añadir 150 μL de perlas preparadas previamente (paso 6.3) a 150 μL de la muestra (paso 5.3). Incubar durante 20 min a RT con rotación (15-20 rpm). Coloque los tubos en un imán apropiado y espere hasta que la solución se aclare (1-2 min). Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas en 300 μL de 1x TBW. Repita este paso. Coloque los tubos en un imán apropiado y espere hasta que la solución se aclare (1-2 min). Retirar el sobrenadante y volver a suspender las perlas en 100 μL de 0,1x TE (1 mM de Tris, 0,1 mM de EDTA, pH 8,0). Coloque los tubos en un imán apropiado y espere hasta que la solución se aclare (1-2 min). Retirar el sobrenadante, resuspender las perlas en 50 μL de TE 0,1x y transferirlas a tubos de PCR.NOTA: El volumen de 0,1x TE utilizado (50 μL) corresponde al volumen de entrada del kit de preparación de la biblioteca de secuenciación de ADN (véase la Tabla de materiales) utilizado en este protocolo. Si se utiliza un kit o una estrategia diferente, ajuste el volumen en consecuencia. Realice los pasos de manipulación del ADN del kit de preparación de la biblioteca de secuenciación de acuerdo con el protocolo del fabricante. Estos pasos suelen incluir el embotamiento del ADN, la cola A, la ligadura del adaptador y la escisión en U. El último paso (escisión en U) es específico del kit utilizado en este estudio. Si utiliza ese kit, siga las instrucciones del fabricante desde el paso 1 hasta el paso 2.6 del protocolo del kit utilizando adaptadores no diluidos, y no considere el almacenamiento a -20 °C después del paso 2.6.NOTA: Los cambios de tampón requeridos por los kits de secuenciación deben intercambiarse mediante la unión de las perlas a un imán y lavados (pasos 7.3 a 7.4), ya que el ADN todavía está unido a las perlas de estreptavidina. Además, debido a que el ADN está unido a las perlas magnéticas, ignore cualquier paso de purificación y selección de tamaño después de la ligadura del adaptador del protocolo del kit. Continúe con el paso 7.6 (este protocolo). Una vez completada la ligadura del adaptador, lave la muestra como se describe en el paso 7.2. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas en 20 μL de 0,1x TE. 8. Estimación de los ciclos de PCR requeridos NOTA: Se recomienda estimar los ciclos de PCR necesarios para la amplificación de la biblioteca. Por lo general, una biblioteca Micro-C requiere de 8 a 15 ciclos de PCR. Aunque el paso no es esencial, ayuda a evitar la sobreamplificación y reduce el riesgo de duplicados de PCR. Para definir el número mínimo de ciclos de PCR necesarios, realice la PCR con 1 μL de muestra de estreptavidina-biotina-ADN (paso 7.6). Para ello, añada a la muestra la mezcla maestra de PCR (3,2 μL deH2O, 0,4 μL de cebador i5, 0,4 μL de cebador i7 y 5 μL de ADN polimerasa Q5 de alta fidelidad). Realice la PCR con 16 ciclos de acuerdo con las instrucciones del fabricante para el kit de preparación de la biblioteca de ADN utilizado.NOTA: Los cebadores utilizados aquí se compran en un kit separado (consulte la Tabla de materiales) que debe ser compatible con el kit de preparación de la biblioteca utilizado. Después de la PCR, recoja las perlas con un imán adecuado y mida la concentración de ADN de 1 μL del sobrenadante utilizando un instrumento de cuantificación de ADN de alta sensibilidad (ver Tabla de materiales). Para obtener la concentración total de ADN, multiplique este valor por 10 (volumen total de la reacción de PCR). Calcule el número requerido de ciclos de PCR como se discute en los resultados representativos. Agregue 2 μL de tampón de carga 6x a los 9 μL restantes de mezcla de PCR. Resuelva la biblioteca amplificada de PCR en un gel de agarosa al 1% para determinar el éxito de la ligadura del adaptador, lo que da como resultado un tamaño de aproximadamente 450 pb (Figura 1C).NOTA: El gel debe mostrar una banda distintiva de aproximadamente 420 pb (biblioteca Micro-C más adaptadores). Las bandas de 120 pb representan dímeros adaptadores y son indicativas de bibliotecas de baja complejidad. Pueden aparecer bandas de menor peso molecular (menos de 100 pb), y se trata de cebadores no utilizados de la reacción de PCR. 9. Amplificación de la biblioteca de secuenciación Añadir mezcla maestra de PCR (65 μL deH2O, 100 μL de ADN polimerasa de alta fidelidad Q5, 8 μL de cebador i5, 8 μL de cebador i7) a los 19 μL restantes de la muestra de estreptavidina-biotina-ADN. Divida la mezcla de reacción en alícuotas de 50-100 μL.NOTA: El volumen óptimo para la PCR depende de la máquina de PCR; Por lo general, 50 μL ofrecen la amplificación más reproducible en las máquinas de PCR comunes. Realice la PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante del kit de preparación de la biblioteca de ADN con el número de ciclos determinado en el paso 8. Si se omitió el paso 8, se recomiendan 14 ciclos para la PCR. Purifique el ADN con perlas paramagnéticas (consulte la Tabla de materiales) en una proporción de 1:0.9 de acuerdo con el protocolo del fabricante. Eluir en 20 μL de TE al 0,1%.NOTA: Si se detectan dímeros adaptadores en el paso 8.5, realice la purificación dos veces utilizando la misma proporción. Determine la concentración de ADN y ejecute las muestras en un sistema de control de calidad (consulte la tabla de materiales). Asegure una buena calidad de la biblioteca Micro-C mediante la presencia de una sola banda precisa (Figura 1D).NOTA: Los dímeros adaptadores son poco comunes en las preparaciones de bibliotecas en cordones debido a los lavados de muestras antes de la PCR. Por lo tanto, la aparición de dímeros adaptadores indica una baja complejidad de la biblioteca. Si se observan dímeros adaptadores, se recomienda encarecidamente controlar la calidad de la muestra con una secuenciación de entrada baja. 10. Secuenciación del ADN y procesamiento de datos Secuenciar la biblioteca Micro-C con secuenciación de extremos emparejados de acuerdo con los requisitos del proveedor de secuenciación.NOTA: Idealmente, las muestras se secuencian en una plataforma en modo de extremo emparejado con 50 pb por lectura. Las plataformas más antiguas que ofrecen longitudes de lectura más cortas, como 2 x 35 pb, también se han utilizado con éxito. Es importante destacar que, si se estudian regiones genómicas repetitivas, podría ser aconsejable secuenciar con una longitud de lectura más larga. Para evaluar la calidad de la biblioteca Micro-C, realice una secuenciación de entrada baja con 5 x 106 a 1 x 107 lecturas por muestra. Procese los archivos de secuenciación (archivos fastq) con Distiller10. Asigne las lecturas con el genoma de referencia apropiado, aquí mm10.NOTA: Los archivos de secuenciación se pueden procesar mediante varias canalizaciones en equipos locales o clústeres informáticos. En el caso de las muestras con profundidades de secuenciación bajas, los tamaños de ubicación más grandes, como 10.000 pb, 50.000 pb, 100.000 pb y 500.000 pb, pueden reducir las demandas informáticas y el tamaño de los archivos. Distiller (utilizado en este estudio) genera todos los tipos de archivos necesarios para evaluar la calidad de la biblioteca Micro-C. El archivo *.stats generado contiene la información sobre la velocidad del mapa, las relaciones cis-trans y la orientación de lectura estratificada por la distancia entre los pares de lectura. Estos parámetros se visualizan en la Figura 2, y la evaluación de la calidad de la biblioteca Micro-C se discute en los resultados representativos. El software de procesamiento también genera archivos mcool que se pueden cargar directamente en HiGlass (https://docs.higlass.io/) para generar matrices de interacción9.