Artemia salina L. Kullanarak Öldürücülük Biyotahlili
Özet
Bu çalışma, tuzlu su karides öldürücülük testi olarak da tanımlanan Artemia salina öldürücülük biyotahlil prosedürünü değerlendirmeyi ve gözden geçirmeyi amaçlamaktadır. Bu basit ve ucuz yöntem, numunelerin, yani doğal ürünlerin genel toksisitesi (ön toksisite değerlendirmesi olarak kabul edilir) hakkında bilgi verir.
Abstract
Doğal ürünler antik çağlardan beri ilaç üretmek için kullanılmıştır. Günümüzde, doğal kaynaklardan elde edilen ve çok sayıda hastalığa karşı kullanılan birçok kemoterapötik ilaç bulunmaktadır. Ne yazık ki, bu bileşiklerin çoğu sıklıkla sistemik toksisite ve yan etkiler gösterir. Seçilmiş potansiyel biyoaktif örneklerin tolere edilebilirliğini daha iyi değerlendirmek için, tuzlu su karidesi (Artemia salina) genellikle öldürücülük çalışmalarında bir model olarak kullanılır. A. salina testi, çalışılan biyoaktif bileşiklerin larva evrelerinde (nauplii) mikrokabukluları öldürme yeteneğine dayanmaktadır. Bu yöntem, sitotoksisite çalışmaları ve sentetik, yarı sentetik ve doğal ürünlerin genel toksisite taraması için uygun bir başlangıç noktasını temsil eder. Yukarıda belirtilen amaçlar için genellikle uygun olan diğer birçok tahlille (in vitro hücreler veya maya suşları, zebra balığı, kemirgenler) karşılaştırıldığında basit, hızlı ve düşük maliyetli bir tahlil olarak kabul edilebilir; dahası, herhangi bir özel eğitim olmadan bile kolayca gerçekleştirilebilir. Genel olarak, A. salina testi, seçilen bileşiklerin ön toksisite değerlendirmesi ve doğal ürün ekstraktlarının biyo-rehberli fraksiyonasyonu için yararlı bir araçtır.
Introduction
Bitkilerden, hayvanlardan veya mikroorganizmalardan elde edilen doğal ürünler, çeşitli biyolojik ve farmakolojik aktiviteleri nedeniyle yeni biyoaktif moleküllerin geliştirilmesinde yıllar içinde artan bir ilgi alanı olmuştur1. Bununla birlikte, ilişkili yan etkiler, ilaç direnci veya ajanların yetersiz özgüllüğü, özellikle antikanser ilaçları olarak kullanıldığında, etkisiz tedaviye yol açabilecek başlıca faktörleri temsil etmektedir 1,2.
Son birkaç on yılda, bazıları antikanser ajanları olarak kullanılan birkaç bitki kaynaklı sitotoksik ajan keşfedilmiştir 1,2,3. Bu bağlamda paklitaksel, doğal kökenli en iyi bilinen ve en aktif kemoterapötik ilaçlardan biri olarak bildirilmektedir 3,4. Şu anda, piyasadaki tüm ilaçların% 35’inden fazlasının doğal ürünlerden türetildiği veya bunlardan ilham aldığı tahmin edilmektedir5. Bu bileşiklerin potansiyel yüksek toksisitesi, tüm çalışma aşamalarında dikkate alınmasını gerektirir, çünkü farklı kirletici maddeler ve hatta bitkinin metabolik bileşenleri toksik etkilere neden olabilir. Bu nedenle, yeni potansiyel bitki bazlı tedavilerin biyolojik aktivitesini ve güvenliğini değerlendirmek için ön aşamada farmakolojik ve toksikolojik profiller yapılmalıdır. Yeni biyoaktif örneklerin toksisitesini değerlendirmek için, omurgasız hayvanlar incelenecek en iyi modeller olarak düşünülebilir. Minimum etik gereklilikler talep ederler ve omurgalılarda bir sonraki test turu için en umut verici ürünlere öncelik vermek için ön in vitro testlere izin verirler 1,6.
Genellikle tuzlu su karidesi olarak bilinen A. salina, Artemia cinsine ait küçük bir halofilik omurgasızdır (Artemiidae familyası, Anostraca, subphylum Crustacea; Şekil 1). Deniz ve sucul tuzlu su ekosistemlerinde, tuzlu su karidesleri mikroalglerle beslendikleri ve balıkları beslemek için kullanılan zooplanktonun bileşenleri oldukları için önemli bir besinsel rol oynarlar. Ayrıca, larvaları (nauplii olarak bilinir), ön çalışmalarsırasında genel toksisitenin değerlendirilmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır 1,3,7.
Artemia spp. öldürücülük çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır ve aynı zamanda laboratuvarda yetiştirilen nauplii’yi öldürme yeteneklerine dayanarak potansiyel olarak biyoaktif bileşiklerin toksisitesini izleyerek toksisite değerlendirmeleri için uygun bir başlangıç noktasıdır 1,8. Bu nedenle, A. salina kullanımı genel toksisite çalışmalarında cazibe kazanmıştır, çünkü hayvan modelleri9 üzerindeki diğer testlere kıyasla çok verimli ve kullanımı kolay bir yöntemdir.
Basit anatomileri, küçük boyutları ve kısa yaşam döngüleri sayesinde, çok sayıda omurgasız tek bir deneyde incelenebilir. Bu nedenle, genetik uygunluğu ve düşük maliyetli uyumluluğu büyük ölçekli taramalarla birleştirirler1. Bu bağlamda, genel bir toksisite tahlilinde tuzlu su karidesinin kullanılması, hızlı büyüme (kuluçkadan ilk sonuçlara kadar 28-72 saat gereklidir), maliyet etkinliği ve ticari yumurtaların uzun raf ömrü gibi tüm yıl boyunca kullanılabilen 3,10 gibi çeşitli avantajlar göstermektedir. Öte yandan, omurgasızlar ilkel bir organ sistemine sahip olduklarından ve adaptif bir bağışıklık sisteminden yoksun olduklarından, insan hücreleri için mükemmel ve güvenilir bir model temsil etmezler1.
Bununla birlikte, seçilen numunelerin genel toksisitesi için bir ön değerlendirme yöntemi sağlar. Ölümcül bir tahlil olarak yaygın olarak kullanıldığından, potansiyel antikanser ajanlarının toksik etkileri hakkında geçici endikasyonlar sağlayabilir. Genellikle Artemia karidesleri arasında mümkün olan en düşük ölüm oranını göstermenin gerekli olduğu diğer biyolojik aktivitelerle donatılmış bileşiklerin genel toksisitesi hakkında geri bildirim almak için de kullanılır.
Grubumuzdan devam eden bir çalışmada, Plectranthus türlerinden elde edilen farklı ekstraktlar antioksidan ve antimikrobiyal aktiviteler göstermiştir (yayınlanmamış sonuçlar). Paralel olarak, ekstraktların saflaştırılmasıyla izole edilmiş bileşikler elde edildi ve daha sonra kimyasal olarak modifiye edildi. Ekstraktlar, saf bileşikler ve yarı sentetik türevler daha sonra genel toksisite açısından test edildi. Bu bağlamda, bu çalışma, Plectranthus11 cinsinin farklı bitkilerinden biyoaktif ekstraktların ve izole edilmiş bileşiklerin genel toksisitesi ve potansiyel sitotoksik aktivitesinin değerlendirilmesi için Artemia öldürücülük biyotestinin kullanımına genel bir bakış sunmayı amaçlamaktadır.
Resim 1: Mikroskop altında Artemia salina . Mikroskop altında görüldüğü gibi A. salina’nın yeni yumurtadan çıkmış nauplii (büyütme 12x). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Son yıllarda, bilimsel topluluk toksisite taramaları için alternatif modellere olan dikkatini artırmıştır21. A. salina öldürücülük biyotahlilinin yanı sıra, diğer metodolojiler genellikle numune tolere edilebilirliğinin değerlendirilmesi için yapılır ve omurgalı biyotahlilleri (kemirgenler gibi), omurgasızlar (zebra balığı gibi), maya suşları veya hücreleri kullanan in vitro yöntemler ve siliko yöntemler22,23,24,25<su…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Profesör Amilcar Roberto’nun anısına.
Bu çalışma, CBIOS ve doktora hibesi SFRH / BD / 018’e (Vera Isca) atfedilen UIDB / 04567/2020 ve UIDP / 04567 / 2020 projeleri kapsamında Fundação para a Ciência e a 137671 Tecnologia (FCT, Portekiz) tarafından finansal olarak desteklenmiştir.
Materials
| 24-well plates | Thermo Fisher Scientific, Denmark | 174899 | Thermo Scientific Nunc Up Cell 24 multidish |
| Aluminium foil | Albal | – | Can be purchased in supermarket |
| Artemio Set | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 61066000 | Can be purchased in pet shops |
| Binocular microscope | Ceti, Belgium | 1700.0000 | Flexum-24AED, 220-240 V, 50 Hz |
| Bottles | – | – | 0.5 L Diameter: 5.8 cm; Height: 12 cm |
| Brine shrimp cysts | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090700 | Can be purchased in pet shops |
| Brine shrimp salt | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | 3090600 | Can be purchased in pet shops |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | VWR chemicals | CAS: 67-68-5 | 99% purity |
| Discartable tips | Diamond | F171500 | Volume range: 100 – 1000 µL |
| Eppendorf microtubes | BRAND | 7,80,546 | Microtubes, PP, 2 mL, BIO-CERT PCR QUALITY |
| Erlenmeyer flask | VWR chemicals | 4,47,109 | volume: 100 mL |
| Glass beaker | Normax | 3.2111654N | Volume: 1000 mL |
| Gloves | Guantes Luna | GLSP3 | – |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, CA, USA | – | GraphPad Prism version 5.00 for Windows, www.graphpad.com, accessed on 5 February 2021; commercial statistical analysis software |
| Home-made A. salina Grower | - | - | Home made: two plastic bottles connected by a hose |
| Hot glue | Parkside | PHP500E3 | 230 V, 50 Hz, 25 W |
| Incubator | Heidolph Instruments, Denmark | - | One Heidolph Unimax 1010 equipment and one Heidolph Inkubator 1006 |
| Light | Roblan | SKYC3008FE14 | LED light bulb |
| Micropipettes | VWR chemicals | 613-5265 | Volume range: 100 – 1000 µL |
| Potassium dichromate (K2Cr2O7) | VWR chemicals | CAS: 7778-50-9 | 99% purity |
| Pump ProAir a50 | JBL GmbH and Co. KG, D-67141, Neuhofen Germany | - | Included in the Artemio Set+1 kit |
| Rubber tube | – | – | 1.3 cm outer and 0.9 cm inner diameter |
| Stirring rod | VWR chemicals | 441-0147 |  6 mm, 250 mm |
| Termometer | VWR chemicals | 620-0821 | 0 – 100 °C |
Referanslar
- Ntungwe, N. E., et al. Artemia species: An important tool to screen general toxicity samples. Current Pharmaceutical Design. 26 (24), 2892-2908 (2020).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. 1830 (6), 3670-3695 (2013).
- Ntungwe, E., et al. General toxicity screening of Royleanone derivatives using an artemia salina model. Journal Biomedical and Biopharmaceutical Research. 18 (1), 114 (2021).
- Seca, A., Plant Pinto, D. secondary metabolites as anticancer agents: Successes in clinical trials and therapeutic application. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 263 (2018).
- Calixto, J. B. The role of natural products in modern drug discovery. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91 (3), 1-7 (2019).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Zhang, Y., Mu, J., Han, J., Gu, X. An improved brine shrimp larvae lethality microwell test method. Toxicology Mechanisms and Methods. 22 (1), 23-30 (2012).
- Domínguez-Villegas, V., et al. antioxidant and cytotoxicity activities of methanolic extract and prenylated flavanones isolated from leaves of eysehardtia platycarpa. Natural Product Communications. 8 (2), 177-180 (2013).
- Hamidi, M. R., Jovanova, B., Panovska, T. K. Toxicological evaluation of the plant products using Brine Shrimp (Artemia salina L.) model. Macedonian Pharmaceutical Bulletin. 60 (01), 9-18 (2014).
- Libralato, G., Prato, E., Migliore, L., Cicero, A. M., Manfra, L. A review of toxicity testing protocols and endpoints with Artemia spp. Ecological Indicators. 69, 35-49 (2016).
- Mendes Hacke, A. C., et al. Cytotoxicity of cymbopogon citratus (DC) Stapf fractions, essential oil, citral, and geraniol in human leukocytes and erythrocytes. Journal of Ethnopharmacology. 291, 115147 (2022).
- Thangapandi, V., Pushpanathan, T. Comparison of the Artemia salina and Artemia fransiscana bioassays for toxicity of Indian medicinal plants. Journal of Coastal Life Medicine. 2 (6), 453-457 (2014).
- Syahmi, A. R. M., et al. Acute oral toxicity and brine shrimp lethality of Elaeis guineensis Jacq., (Oil Palm Leaf) methanol extract. Molecules. 15 (11), 8111-8121 (2010).
- Sasidharan, S., et al. Acute toxicity impacts of Euphorbia hirta L extract on behavior, organs body weight index and histopathology of organs of the mice and Artemia salina. Pharmacognosy Research. 4 (3), 170 (2012).
- Libralato, G. The case of Artemia spp. in nanoecotoxicology. Marine Environmental Research. 101, 38-43 (2014).
- Okumu, M. O., et al. Artemia salina as an animal model for the preliminary evaluation of snake venom-induced toxicity. Toxicon: X. 12, 100082 (2021).
- Rajabi, S., Ramazani, A., Hamidi, M., Naji, T. Artemia salina as a model organism in toxicity assessment of nanoparticles. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences. 23 (1), 20 (2015).
- Svensson, B. -. M., Mathiasson, L., Mårtensson, L., Bergström, S. Artemia salina as test organism for assessment of acute toxicity of leachate water from landfills. Environmental Monitoring and Assessment. 102 (1), 309-321 (2005).
- Banti, C., Hadjikakou, S. Evaluation of toxicity with brine shrimp assay. Bio-Protocol. 11 (2), 3895 (2021).
- Pecoraro, R., et al. Artemia salina: A microcrustacean to assess engineered nanoparticles toxicity. Microscopy Research and Technique. 84 (3), 531-536 (2021).
- Lillicrap, A., et al. Alternative approaches to vertebrate ecotoxicity tests in the 21st century: A review of developments over the last 2 decades and current status. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (11), 2637-2646 (2016).
- Ribeiro, I. C., et al. Yeasts as a model for assessing the toxicity of the fungicides Penconazol, Cymoxanil and Dichlofulanid. Chemosphere. (10), 1637-1642 (2000).
- Armour, C. D., Lum, P. Y. From drug to protein: using yeast genetics for high-throughput target discovery. Current Opinion in Chemical Biology. 9 (1), 20-24 (2005).
- Modarresi Chahardehi, A., Arsad, H., Lim, V. Zebrafish as a successful animal model for screening toxicity of medicinal plants. Plants. 9 (10), 1345 (2020).
- Fischer, I., Milton, C., Wallace, H. Toxicity testing is evolving. Toxicology Research. 9 (2), 67-80 (2020).
- de Araújo, G. L., et al. Alternative methods in toxicity testing: the current approach. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. 50 (1), 55-62 (2014).
- Toussaint, M., et al. A high-throughput method to measure the sensitivity of yeast cells to genotoxic agents in liquid cultures. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 606 (1), 92-105 (2006).
- Horzmann, K. A., Freeman, J. L. Making waves: New developments in toxicology with the zebrafish. Toxicological Sciences. 163 (1), 5-12 (2018).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Cunliffe, V. T., Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
- Sitarek, P., et al. Insight the biological activities of selected Abietane Diterpenes isolated from Plectranthus spp. Biomolecules. 10 (2), 194 (2020).
- Matias, D., et al. Cytotoxic activity of Royleanone Diterpenes from Plectranthus madagascariensis Benth. ACS Omega. 4 (5), 8094-8103 (2019).
- Garcia, C., et al. Royleanone derivatives from Plectranthus spp. as a novel class of P-glycoprotein inhibitors. Frontiers in Pharmacology. 11, (2020).
