Determinación de cinética de encendido in vitro y celular para aptámeros de ARN fluorogénicos
Özet
El protocolo presenta dos métodos para determinar la cinética de los aptámeros de ARN fluorogénico Spinach2 y Brócoli. El primer método describe cómo medir la cinética del aptámero fluorogénico in vitro con un lector de placas, mientras que el segundo método detalla la medición de la cinética del aptámero fluorogénico en las células mediante citometría de flujo.
Abstract
Los aptámeros de ARN fluorogénico se han aplicado en células vivas para etiquetar y visualizar ARN, informar sobre la expresión génica y activar biosensores fluorescentes que detectan niveles de metabolitos y moléculas de señalización. Para estudiar los cambios dinámicos en cada uno de estos sistemas, es deseable obtener mediciones en tiempo real, pero la precisión de las mediciones depende de que la cinética de la reacción fluorogénica sea más rápida que la frecuencia de muestreo. Aquí, describimos métodos para determinar la cinética de encendido in vitro y celular para aptámeros de ARN fluorogénicos utilizando un lector de placas equipado con un inyector de muestras y un citómetro de flujo, respectivamente. Mostramos que la cinética in vitro para la activación de fluorescencia de los aptámeros de espinaca2 y brócoli se puede modelar como reacciones de asociación de dos fases y tienen diferentes constantes de velocidad de fase rápida de 0.56 s−1 y 0.35 s−1, respectivamente. Además, mostramos que la cinética celular para la activación de fluorescencia de la espinaca2 en Escherichia coli, que está aún más limitada por la difusión del colorante en las bacterias gramnegativas, sigue siendo lo suficientemente rápida como para permitir una frecuencia de muestreo precisa en la escala de tiempo diminuta. Estos métodos para analizar la cinética de activación de fluorescencia son aplicables a otros aptámeros de ARN fluorogénicos que se han desarrollado.
Introduction
Las reacciones fluorogénicas son reacciones químicas que generan una señal de fluorescencia. Los aptámeros de ARN fluorogénico suelen realizar esta función uniendo un colorante de molécula pequeña para mejorar su rendimiento cuántico de fluorescencia (Figura 1A)1. Se han desarrollado diferentes sistemas de aptámeros de ARN fluorogénicos que consisten en secuencias específicas de aptámeros de ARN y los correspondientes ligandos de colorante1. Los aptámeros de ARN fluorogénicos se han añadido a las transcripciones de ARN como etiquetas fluorescentes que permiten obtener imágenes de células vivas de ARNm y ARN no codificantes 2,3,4. También se han colocado después de secuencias promotoras como reporteros fluorescentes de expresión génica, similar al uso de proteína fluorescente verde (GFP) como reportero, excepto que la función de informe está en el nivel de ARN 5,6. Finalmente, los aptámeros de ARN fluorogénico se han incorporado a biosensores fluorescentes basados en ARN, que están diseñados para desencadenar la reacción fluorogénica en respuesta a una molécula pequeña específica. Se han desarrollado biosensores fluorescentes basados en ARN para obtener imágenes de células vivas de varios metabolitos no fluorescentes y moléculas de señalización 7,8,9,10,11.
Existe un creciente interés en el desarrollo de aptámeros de ARN fluorogénicos para visualizar cambios dinámicos en la localización del ARN, la expresión génica y las señales de moléculas pequeñas. Para cada una de estas aplicaciones, es deseable obtener mediciones en tiempo real, pero la precisión de las mediciones depende de que la cinética de la reacción fluorogénica sea más rápida que la frecuencia de muestreo. Aquí, describimos métodos para determinar la cinética in vitro para los aptámeros de ARN fluorogénicos Spinach212 y Brócoli13 utilizando un lector de placas equipado con un inyector de muestras y para determinar la cinética de activación celular para Spinach2 expresada en Escherichia coli utilizando un citómetro de flujo. Estos dos aptámeros de ARN fueron elegidos porque se han aplicado para estudiar la localización de ARN 2,3,4, se han utilizado en reporteros5,6 y biosensores 7,8,9,10,11, y los ligandos de colorante correspondientes (DFHBI o DFHBI-1T) están disponibles comercialmente. Un resumen de sus propiedades in vitro determinadas en la literatura se da en la Tabla 1 4,13,14, que informó el desarrollo del protocolo (por ejemplo, las longitudes de onda y las concentraciones de colorantes utilizadas). Estos resultados demuestran que las reacciones fluorogénicas afectadas por los aptámeros de ARN son rápidas y no deben impedir mediciones precisas para las aplicaciones biológicas celulares deseadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para el experimento de cinética in vitro , se puede modificar el mismo protocolo general para medir la cinética in vitro de un biosensor fluorescente basado en ARN que contiene un dominio de unión a ligando y de unión a fluoróforos8. En este caso, el ARN debe incubarse con el fluoróforo antes de las mediciones al inyectar el ligando para obtener la cinética de respuesta del ligando. Si se observa una alta variabilidad entre las réplicas, se puede solucionar el problema ve…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones a MCH: NSF-BSF 1815508 y NIH R01 GM124589. MRM fue parcialmente apoyado por la subvención de capacitación NIH T32 GM122740.
Materials
| Agarose | Thermo Fischer Scientific | BP160500 | |
| Agarose gel electrophoresis equipment | Thermo Fischer Scientific | B1A-BP | |
| Alpha D-(+)-lactose monohydrate | Thermo Fischer Scientific | 18-600-440 | |
| Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | 22431021 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| Attune NxT Flow cytometer | Thermo Fischer Scientific | A24861 | |
| Attune 1x Focusing Fluid | Thermo Fischer Scientific | A24904 | |
| Attune Shutdown Solution | Thermo Fischer Scientific | A24975 | |
| Attune Performance Tracking Beads | Thermo Fischer Scientific | 4449754 | |
| Attune Wash Solution | Thermo Fischer Scientific | J24974 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C3416 | |
| Chlorine Bleach | Amazon | B07J6FJR8D | |
| Corning Costar 96-well plate | Daigger Scientific | EF86610A | |
| Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap | Globe Scientific | 05-402-31 | |
| DFHBI | Sigma-Aldrich | SML1627 | |
| DFHBI-1T | Sigma-Aldrich | SML2697 | |
| D-Glucose (anhydrous) | Acros Organics | AC410955000 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| DNA loading dye | New England Biolabs | B7025S | |
| DNA LoBind Tubes (2.0 mL) | Eppendorf | 22431048 | |
| dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP | New England Biolabs | N0446S | |
| EDTA, pH 8.0 | Gibco, Life Technologies | AM9260G | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Filter-tip micropipettor tips | Thermo Fischer Scientific | AM12635, AM12648, AM12655, AM12665 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | N/A | FlowJo v10 Software |
| Fluorescent plate reader with heating control | VWR | 10014-924 | |
| Gel electrophoresis power supply | Thermo Fischer Scientific | EC3000XL2 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycogen AM95010 | Thermo Fischer Scientific | AM95010 | |
| GraphPad Prism | Dotmatics | N/A | Analysis software from Academic Group License |
| Heat block | Thomas Scientific | 1159Z11 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma-Aldrich | I1643-500UN | |
| Low Molecular Weight DNA Ladder | New England Biolabs | N3233L | Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025). |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher Scientific | MFCD00011110 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
| Microcentrifuge with temperature control | Marshall Scientific | EP-5415R | |
| Micropipettors | Gilson | FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M | |
| Micropipettor tips | Sigma-Aldrich | Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR | |
| Millipore water filter with BioPak unit | Sigma-Aldrich | CDUFBI001, ZRQSVR3WW | |
| Narrow micropipettor pipette tips | DOT Scientific | RN005R-LRS | |
| PBS, 10x | Thermo Fischer Scientific | BP39920 | |
| PCR clean-up kit | Qiagen | 28181 | |
| PCR primers and templates | Integrated DNA technologies | ||
| PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes | Bio-Rad | 1851148 | |
| PCR thermocycler for 0.5 mL tubes | Techne | 5PRIME/C | |
| pET31b-T7-Spinach2 Plasmid | Addgene | Plasmid #79783 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530L | Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions. |
| Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific | C.B.S. Scientific | VGC-1508 | |
| Polyacrylamide gel electrophoresis equipment | C.B.S. Scientific | ASG-250 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Razor blades | Genesee Scientific | 38-101 | |
| rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP | New England Biolabs | N0450L | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Short wave UV light source | Thermo Fischer Scientific | 11758221 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Thermo Fischer Scientific | S375-500 | |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License |
| Sterile filter units | Thermo Fischer Scientific | 09-741-88 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Thermo Fischer Scientific | S33102 | |
| TAE buffer for agarose gel electrophoresis | Thermo Fischer Scientific | AM9869 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Tryptone (granulated) | Thermo Fischer Scientific | M0251S | |
| T7 RNA polymerase | New England Biolabs | M0251S | |
| Urea-PAGE Gel system | National Diagnostics | EC-833 | |
| UV fluorescent TLC plate | Sigma-Aldrich | 1.05789.0001 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-8000-GL | |
| Vortex mixer | Thermo Fischer Scientific | 2215415 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| Yeast Extract (Granulated) | Thermo Fischer Scientific | BP9727-2 |
Referanslar
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