Determinação da Cinética de Ativação In Vitro e Celular para Aptamers de RNA Fluorogênico
Özet
O protocolo apresenta dois métodos para determinar a cinética dos aptâmeros de RNA fluorogênico Espinafre2 e Brócolis. O primeiro método descreve como medir a cinética do aptâmero fluorogênico in vitro com um leitor de placas, enquanto o segundo método detalha a medição da cinética do aptâmero fluorogênico nas células por citometria de fluxo.
Abstract
Aptâmeros de RNA fluorogênicos têm sido aplicados em células vivas para marcar e visualizar RNAs, relatar a expressão gênica e ativar biossensores fluorescentes que detectam níveis de metabólitos e moléculas de sinalização. Para estudar as mudanças dinâmicas em cada um desses sistemas, é desejável obter medições em tempo real, mas a precisão das medições depende da cinética da reação fluorogênica ser mais rápida do que a frequência de amostragem. Aqui, descrevemos métodos para determinar a cinética de ativação in vitro e celular para aptâmeros de RNA fluorogênicos usando um leitor de placas equipado com um injetor de amostra e um citômetro de fluxo, respectivamente. Mostramos que a cinética in vitro para a ativação por fluorescência dos aptâmeros Espinafre2 e Brócolis pode ser modelada como reações de associação bifásica e tem diferentes constantes de taxa de fase rápida de 0,56 s−1 e 0,35 s−1, respectivamente. Além disso, mostramos que a cinética celular para a ativação por fluorescência do Espinafre2 em Escherichia coli, que é ainda mais limitada pela difusão do corante nas bactérias Gram-negativas, ainda é suficientemente rápida para permitir uma frequência de amostragem precisa na escala de tempo minuto. Esses métodos para analisar a cinética de ativação por fluorescência são aplicáveis a outros aptâmeros de RNA fluorogênicos que foram desenvolvidos.
Introduction
Reações fluorogênicas são reações químicas que geram um sinal de fluorescência. Os aptâmeros de RNA fluorogênicos normalmente desempenham essa função ligando um corante de molécula pequena para aumentar seu rendimento quântico de fluorescência (Figura 1A)1. Diferentes sistemas de aptâmeros de RNA fluorogênicos foram desenvolvidos e consistem em sequências específicas de aptâmeros de RNA e os ligantes corantes correspondentes1. Aptâmeros de RNA fluorogênicos têm sido anexados a transcritos de RNA como etiquetas fluorescentes que permitem a imagem de células vivas de mRNAs e RNAs não codificantes 2,3,4. Eles também foram colocados após sequências promotoras como repórteres fluorescentes de expressão gênica, semelhante ao uso de proteína fluorescente verde (GFP) como repórter, exceto que a função de relato está no nível de RNA 5,6. Finalmente, os aptâmeros de RNA fluorogênicos foram incorporados em biossensores fluorescentes baseados em RNA, que são projetados para desencadear a reação fluorogênica em resposta a uma pequena molécula específica. Biossensores fluorescentes baseados em RNA foram desenvolvidos para imagens de células vivas de vários metabólitos não fluorescentes e moléculas sinalizadoras 7,8,9,10,11.
Há um interesse crescente no desenvolvimento de aptâmeros de RNA fluorogênicos para visualizar mudanças dinâmicas na localização do RNA, expressão gênica e sinais de moléculas pequenas. Para cada uma dessas aplicações, é desejável obter medições em tempo real, mas a precisão das medições depende da cinética da reação fluorogênica ser mais rápida do que a frequência de amostragem. Aqui, descrevemos métodos para determinar a cinética in vitro para os aptâmeros de RNA fluorogênico Espinafre2 12 e Brócolis13 usando um leitor de placas equipado com um injetor de amostra e para determinar a cinética de ativação celular para Espinafre2 expressa em Escherichia coli usando um citômetro de fluxo. Esses dois aptâmeros de RNA foram escolhidos por terem sido aplicados para estudar a localização do RNA 2,3,4, terem sido utilizados em repórteres 5,6 e biossensores 7,8,9,10,11, e os ligantes corantes correspondentes (DFHBI ou DFHBI-1T) estarem comercialmente disponíveis. Um resumo de suas propriedades in vitro determinadas na literatura é apresentado na Tabela 1 4,13,14, que informou o desenvolvimento do protocolo (por exemplo, os comprimentos de onda e as concentrações de corantes utilizados). Esses resultados demonstram que as reações fluorogênicas afetadas pelos aptâmeros de RNA são rápidas e não devem impedir medições precisas para as aplicações biológicas celulares desejadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para o experimento de cinética in vitro , o mesmo protocolo geral pode ser modificado para medir a cinética in vitro de um biossensor fluorescente baseado em RNA contendo um domínio de ligação ao ligante e de ligação ao fluoróforo8. Neste caso, o RNA deve ser incubado com o fluoróforo antes das medições após a injeção do ligante, a fim de obter cinética de resposta do ligante. Se for observada alta variabilidade entre as replicações, pode-se solucionar problemas …
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelas seguintes subvenções à MCH: NSF-BSF 1815508 e NIH R01 GM124589. O MRM foi parcialmente apoiado pela bolsa de treinamento NIH T32 GM122740.
Materials
| Agarose | Thermo Fischer Scientific | BP160500 | |
| Agarose gel electrophoresis equipment | Thermo Fischer Scientific | B1A-BP | |
| Alpha D-(+)-lactose monohydrate | Thermo Fischer Scientific | 18-600-440 | |
| Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | 22431021 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| Attune NxT Flow cytometer | Thermo Fischer Scientific | A24861 | |
| Attune 1x Focusing Fluid | Thermo Fischer Scientific | A24904 | |
| Attune Shutdown Solution | Thermo Fischer Scientific | A24975 | |
| Attune Performance Tracking Beads | Thermo Fischer Scientific | 4449754 | |
| Attune Wash Solution | Thermo Fischer Scientific | J24974 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C3416 | |
| Chlorine Bleach | Amazon | B07J6FJR8D | |
| Corning Costar 96-well plate | Daigger Scientific | EF86610A | |
| Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap | Globe Scientific | 05-402-31 | |
| DFHBI | Sigma-Aldrich | SML1627 | |
| DFHBI-1T | Sigma-Aldrich | SML2697 | |
| D-Glucose (anhydrous) | Acros Organics | AC410955000 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| DNA loading dye | New England Biolabs | B7025S | |
| DNA LoBind Tubes (2.0 mL) | Eppendorf | 22431048 | |
| dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP | New England Biolabs | N0446S | |
| EDTA, pH 8.0 | Gibco, Life Technologies | AM9260G | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Filter-tip micropipettor tips | Thermo Fischer Scientific | AM12635, AM12648, AM12655, AM12665 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | N/A | FlowJo v10 Software |
| Fluorescent plate reader with heating control | VWR | 10014-924 | |
| Gel electrophoresis power supply | Thermo Fischer Scientific | EC3000XL2 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycogen AM95010 | Thermo Fischer Scientific | AM95010 | |
| GraphPad Prism | Dotmatics | N/A | Analysis software from Academic Group License |
| Heat block | Thomas Scientific | 1159Z11 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma-Aldrich | I1643-500UN | |
| Low Molecular Weight DNA Ladder | New England Biolabs | N3233L | Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025). |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher Scientific | MFCD00011110 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
| Microcentrifuge with temperature control | Marshall Scientific | EP-5415R | |
| Micropipettors | Gilson | FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M | |
| Micropipettor tips | Sigma-Aldrich | Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR | |
| Millipore water filter with BioPak unit | Sigma-Aldrich | CDUFBI001, ZRQSVR3WW | |
| Narrow micropipettor pipette tips | DOT Scientific | RN005R-LRS | |
| PBS, 10x | Thermo Fischer Scientific | BP39920 | |
| PCR clean-up kit | Qiagen | 28181 | |
| PCR primers and templates | Integrated DNA technologies | ||
| PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes | Bio-Rad | 1851148 | |
| PCR thermocycler for 0.5 mL tubes | Techne | 5PRIME/C | |
| pET31b-T7-Spinach2 Plasmid | Addgene | Plasmid #79783 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530L | Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions. |
| Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific | C.B.S. Scientific | VGC-1508 | |
| Polyacrylamide gel electrophoresis equipment | C.B.S. Scientific | ASG-250 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Razor blades | Genesee Scientific | 38-101 | |
| rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP | New England Biolabs | N0450L | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Short wave UV light source | Thermo Fischer Scientific | 11758221 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Thermo Fischer Scientific | S375-500 | |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License |
| Sterile filter units | Thermo Fischer Scientific | 09-741-88 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Thermo Fischer Scientific | S33102 | |
| TAE buffer for agarose gel electrophoresis | Thermo Fischer Scientific | AM9869 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Tryptone (granulated) | Thermo Fischer Scientific | M0251S | |
| T7 RNA polymerase | New England Biolabs | M0251S | |
| Urea-PAGE Gel system | National Diagnostics | EC-833 | |
| UV fluorescent TLC plate | Sigma-Aldrich | 1.05789.0001 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-8000-GL | |
| Vortex mixer | Thermo Fischer Scientific | 2215415 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| Yeast Extract (Granulated) | Thermo Fischer Scientific | BP9727-2 |
Referanslar
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