JoVE Journal > Biochemistry
Özet
Abstract
Introduction
Protocol
Sonuçlar
Discussion
Açıklamalar
Acknowledgements
Materials
Referanslar
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biyokimya

İn vitro Membran Eğriliği Algılama Proteinlerinin Çalışması için Nanobar Destekli Bir Lipid Çift Katmanlı Sistem

Published: November 30, 2022
doi:
10.3791/64340
, ,
1School of Chemistry, Chemical Engineering, and Biotechnology,Nanyang Technological University, 2State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry Synthesis Technology, College of Chemical Engineering,Zhejiang University of Technology, 3Institute for Digital Molecular Analytics and Science,Nanyang Technological University

Özet

Burada, in vitro eğrilik algılama yeteneğine sahip proteinlerin karakterizasyonunu sağlayan tanımlanmış bir eğriliğe sahip sentetik bir membran sağlamak için nanobar destekli bir lipit çift katmanlı sistem geliştirilmiştir.

Abstract

Membran eğriliği, hücre göçü, hücre bölünmesi ve vezikül kaçakçılığı gibi hücrelerin çeşitli temel süreçlerinde önemli roller oynar. Sadece hücresel aktiviteler tarafından pasif olarak üretilmez, aynı zamanda protein etkileşimlerini aktif olarak düzenler ve birçok hücre içi sinyallemede rol oynar. Bu nedenle, membran eğriliğinin proteinlerin ve lipitlerin dağılımını ve dinamiklerini düzenlemedeki rolünü incelemek büyük değer taşımaktadır. Son zamanlarda, kavisli membran ve protein in vitro arasındaki ilişkiyi incelemek için birçok teknik geliştirilmiştir. Geleneksel tekniklerle karşılaştırıldığında, yeni geliştirilen nanobar destekli lipit çift katmanlı (SLB), önceden tanımlanmış bir membran eğriliği ve yerel düz kontrol ile desenli nanobar dizileri üzerinde sürekli bir lipit çift katmanı oluşturarak membran eğriliği üretiminde hem yüksek verim hem de daha iyi doğruluk sunar. Hem lipit akışkanlığı hem de kavisli membranlara protein duyarlılığı, floresan mikroskopi görüntüleme kullanılarak kantitatif olarak karakterize edilebilir. Burada, nanobar dizileri içeren fabrikasyon cam yüzeylerde bir SLB’nin nasıl oluşturulacağına ve bu SLB üzerinde eğriliğe duyarlı proteinlerin karakterizasyonuna ilişkin ayrıntılı bir prosedür tanıtılmaktadır. Ek olarak, nanoçip yeniden kullanımı ve görüntü işleme protokolleri ele alınmaktadır. Nanobar-SLB’nin ötesinde, bu protokol eğrilik algılama çalışmaları için her türlü nanoyapılı cam çipine kolayca uygulanabilir.

Introduction

Membran eğriliği, morfogenez, hücre bölünmesi ve hücre göçü1 gibi çeşitli hücresel süreçlerde meydana gelen bir hücrenin kritik bir fiziksel parametresidir. Membran eğriliğinin hücresel olayların basit bir sonucunun ötesinde olduğu artık yaygın olarak kabul edilmektedir; bunun yerine, protein etkileşimlerinin ve hücre içi sinyalleşmenin etkili bir düzenleyicisi olarak ortaya çıkmıştır. Örneğin, klatrin aracılı endositozda yer alan birkaç proteinin tercihen kavisli membrana bağlandığı ve endositoz2 için bir sıcak nokta oluşumuna neden olduğu bulunmuştur. Membran deformasyonunun sitoiskelet kuvvetleri tarafından membran çekilmesi, farklı büyüklükte kafa gruplarına sahip lipit asimetrisinin varlığı, konik şekilli transmembran proteinlerinin varlığı, BAR-domain proteinleri (Bin, amfifin ve Rvs proteinlerinden sonra adlandırılmıştır) gibi membran şekillendirici proteinlerin birikmesi ve amfipatik helislerin membrana yerleştirilmesi gibi birçok farklı nedeni vardır1 . İlginç bir şekilde, bu proteinler ve lipitler sadece zarı deforme etmekle kalmaz, aynı zamanda membran eğriliğini algılayabilir ve tercihli birikim gösterebilir1. Bu nedenle, farklı eğriliklere sahip membranların, bunlara bağlı proteinlerin ve lipitlerin dağılımını ve dinamiklerini ve ilgili hücre içi süreçler üzerindeki potansiyel etkilerini değiştirip değiştirmediğini ve nasıl değiştirdiğini incelemek çok önemlidir.

Hem canlı hücre hem de in vitro sistemlerde kavisli membran ve proteinler arasındaki etkileşimi analiz etmek için birçok teknik geliştirilmiştir. Canlı hücre sistemi, zengin lipit çeşitliliği ve dinamik protein sinyal regülasyonu 2,3,4,5,6,7 ile gerçek bir hücre ortamı sağlar. Bununla birlikte, böyle sofistike bir sistemin, hücre içi ortamdaki belirsizlikler ve dalgalanmalar nedeniyle incelenmesi zordur. Bu nedenle, bilinen lipit türlerinden ve saflaştırılmış proteinlerden oluşan yapay bir membran kullanan in vitro testler, proteinler ve kavisli membranlar arasındaki ilişkiyi karakterize etmek için güçlü sulandırma sistemleri haline gelmiştir. Geleneksel olarak, farklı çaplardaki lipozomlar, eğriliğe duyarlı proteinleri, santrifüj kuvveti kullanan bir ko-sedimantasyon testi veya protein agregasyonunu önlemek için yoğunluk gradyanına sahip bir ko-yüzdürme testi yoluyla tespit etmek için ekstrüzyon ile üretilir 8,9. Bununla birlikte, ekstrüde lipozomların eğriliği, ekstrüder10’da kullanılan membran filtresinin mevcut gözenek boyutu ile sınırlıdır. Tek lipozom eğriliği (SLiC) testinin, farklı çaplara sahip lipozomların floresan etiketli olduğu ve yüzeye hareketsiz hale getirildiği, böylece eğriliğin floresan yoğunluğu11 ile işaretlenebildiği bu sınırlamanın üstesinden geldiği kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, küçük veziküllerde lipit bileşiminde güçlü değişkenlik gözlenmiştir, bu da eğrilik ölçümünün doğruluğunu etkiler12. Tether çekme deneyleri, optik bir cımbız kullanarak dev unilamellar veziküllerden (GUV’ler) çekilen geçici tether üzerindeki eğriliğin daha doğru bir ölçümünü sağlar, burada eğrilik13,14 üretilen membran gerilimi tarafından iyi kontrol edilebilir. Bu yöntem, pozitif veya negatif eğrilik algılama proteinlerini incelemek için uygundur, ancak tüp nesil10’un verimi ile sınırlıdır. Desteklenen membran tüpleri (SMrT) testi, mikroakışkan akışlarla aynı lipit rezervuarından ekstrüde edilen çoklu membran tüplerinin eşzamanlı olarak üretilmesini sağlar. Bununla birlikte, membran eğriliği nanotüp boyunca içsel olarak değişir, bu da floresan yoğunluğuna dayalı eğrilik ölçümünün doğruluğunu tehlikeye atar15,16. Buna karşılık, tasarlanmış topografyaları içeren yüzeylerde desteklenen bir lipit çift katmanlı (SLB) oluşturmak için küçük unilamellar veziküller (SUV’lar, çap <100 nm 17) kullanarak, nanofabrikasyon veya nanomalzemeler tarafından önceden belirlenmiş eğriliklere sahip tek bir çift katmanlı membran üretti18,19,20.

Burada, nanobar dizileri ile imal edilmiş nanoçip yüzeylerinde SLB’nin oluşumu ve proteinlerin in vitro eğrilik hassasiyetini araştırmak için nasıl kullanılabileceği için bir protokol sunuyoruz. Şekil 1’de gösterildiği gibi, tahlilin altı temel bileşeni vardır: A) Çipin mikroakışkan bir oda ile temizlenmesi ve montajı; b) Tanımlanmış lipit bileşimine sahip SUV’ların hazırlanması; C) SLB’nin bir nanoçip üzerinde oluşumu ve eğriliğe duyarlı proteinlerle bağlanması; d) Floresan mikroskobu altında SLB ve eğriliğe duyarlı proteinlerin görüntülenmesi ve karakterizasyonu; e) Çipin yeniden kullanılmak üzere temizlenmesi; f) Protein eğriliği algılama yeteneğinin kantitatif analizi için görüntü işleme. Ayrıntılı protokol aşağıda adım adım açıklanmıştır.

Protocol

1. Nanoçip temizliği Nanoçipi, desenli tarafı yukarı bakacak şekilde 10 mL’lik bir beherin içine yerleştirin.NOT: Bu kuvars nanoçip,21’den önce açıklandığı gibi elektron ışını litografisi ile üretilmiştir. Çip üzerindeki nanoyapının geometrisi ve düzenlemesi özel olarak tasarlanabilir. Burada kullanılan gradyan nanoçubuklarının boyutları 2000 nm uzunluğunda, 600 nm yüksekliğinde ve 100 ila 1000 nm genişliğindedir (100 nm …

Representative Results

Nanobar tasarımı, nanobar genişliği ile tanımlanan eğrilik ve merkezde yerel olarak bir düz / sıfır eğrilik kontrolü ile her iki ucunda yarım daire içeren pozitif eğrilik algılama proteinlerini araştırmak için önerilir (Şekil 2A, B). SLB’nin nanobarlar üzerinde başarılı bir şekilde oluşturulması, Şekil 2C’de gösterildiği gibi tüm nanobar yüzeyi boyunca eşit olarak dağılmış lipit işaretleyici sinyalleri ile s…

Discussion

Burada açıklanan nanobar-SLB sistemi, mevcut birkaç in vitro tahlildeki avantajların benzersiz bir kombinasyonunu sunmaktadır. Proteinlerin lipozom yüzdürme veya sedimantasyon testi olarak yüksek oranda kavisli membranlara tercihli bağlanmasını etkili bir şekilde ortaya çıkarır, ancak çok daha az numune gerektirir ve bireysel nanobarlarda daha doğru tanımlanmış eğrilik sunar 8,29. Ayrıca, SLB hareketli olduğundan ve sürekli olarak…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) ve Nanyang Teknoloji Üniversitesi’ndeki (NTU) Yıkıcı Fotonik Teknolojiler Merkezi’ne (CDPT), nanoyapı imalatını ve SEM görüntülemeyi destekledikleri için, protein saflaştırma için Biyolojik Bilimler Okulu NTU’daki Protein Üretim Platformu’na (PPP) ve konfokal mikroskop için Kimya ve Biyomedikal Mühendisliği NTU Okulu’na teşekkür ederiz. Bu çalışma, Singapur Eğitim Bakanlığı (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 ve MOE-T2EP30220-0009), Araştırma Mükemmeliyet Merkezleri programı kapsamında MOE finansmanı tarafından desteklenen Dijital Moleküler Analitik ve Bilim Enstitüsü (IDMxS), İnsan Sınırı Bilim Programı Vakfı (W. Zhao, RGY0088/2021), NTU Start-up Grant (W. Zhao) tarafından finanse edilmektedir. Araştırma bursu için Kimya ve Biyomedikal Mühendisliği NTU Okulu (X. Miao) ve araştırma bursu için Çin Burs Konseyi (J. Wu).

Materials

Anhydrous Ethanol Sigma-Aldrich 100983
Aluminum foil Diamond RN0879999FU
Amber Vial Sigma-Aldrich 27115-U
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 840032
10 mL Beaker Schott-Duran SCOT211060804
50 mL Beaker Schott-Duran SCOT211061706
1000 mL Beaker Schott-Duran SCOT211065408 The second container 
Chloroform Sigma-Aldrich V800117
Cotton buds Watsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 790404
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids, Inc. 840051
F-BAR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
F-BAR+IDR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP-His Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GraphPad Prism GraphPad V9.0.0
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) Thermo Scientific H325-500
IDR from human FBP17 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJ National Institutes of Health 1.50d
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss  LSM 800 with Airyscan 100x (N.A.1.4) oil objective.
Methanol Fisher scientific 10010240
Mini-extuder  Avanti Polar Lipids, Inc. 610000-1EA
1.5 mL Microtubes Greiner 616201
MATLAB Mathworks R2018b
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm Whatman 800309
Phosphate Bufferen Saline (PBS) Life Technologies Holdings Pte Ltd. 70013
Polydimethylsiloxane (PDMS) Base Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Plasma Cleaner HARRICK PLASMA PDC-002-HP
Quartz Nanochip Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Sodium Hydroxide  Sigma-Aldrich 795429
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt Life Technologies Holdings Pte Ltd. T1395MP
Tweezer Gooi PDC-002-HP
Ultrasonic Cleaners Elma D-78224
Voterx Scientific Industries G560E
Vacuum Desiccator NUCERITE 5312
Water Bath Julabo TW8
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referanslar

  1. McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
  2. Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
  3. Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
  4. Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).
  5. Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
  6. Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).
  7. Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).
  8. Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).
  9. Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
  10. Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).
  11. Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
  12. Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
  13. Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).
  14. Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).
  15. Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).
  16. Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).
  17. Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).
  18. Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).
  19. Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).
  22. Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).
  23. Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).
  24. Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).
  25. Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).
  26. Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).
  27. El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).
  28. Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
  29. Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).
  30. Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
  31. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  32. Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).
  33. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  34. Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).
  35. Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).
  36. Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).
  37. Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).
  38. Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).
  39. Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).
  40. Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).
  41. Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).
  42. Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).
  43. London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).
  44. Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).
  45. Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).
  46. Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).
  47. Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).

Etiketler

Nanobar-supported Lipid BilayerMembrane Curvature SensingProtein DynamicsNanofabricationPiranha SolutionLipid MixtureSUVsPDMS Chamber

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Bu Makaleden Alıntı Yapın
Miao, X., Wu, J., Zhao, W. A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro. J. Vis. Exp. (189), e64340, doi:10.3791/64340 (2022).
Atıfı İndir
Tekrar Baskılar ve İzinler

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image