Un sistema de bicapa lipídica soportado por nanobar para el estudio de proteínas de detección de curvatura de membrana in vitro

La curvatura de la membrana es un parámetro físico crítico de una célula que ocurre en una variedad de procesos celulares como la morfogénesis, la división celular y la migración celular¹. Ahora se reconoce ampliamente que la curvatura de la membrana va más allá de un simple resultado de eventos celulares; En cambio, se ha convertido en un regulador eficaz de las interacciones de proteínas y la señalización intracelular. Por ejemplo, se encontró que varias proteínas involucradas en la endocitosis mediada por clatrina se unen preferentemente a la membrana curva, lo que resulta en la formación de un punto caliente para la endocitosis². Hay muchas causas diferentes de deformación de la membrana, como el tirón de la membrana por las fuerzas citoesqueléticas, la presencia de asimetría lipídica con grupos de cabeza de diferentes tamaños, la existencia de proteínas transmembrana con forma cónica, la acumulación de proteínas formadoras de membrana como las proteínas de dominio BAR (llamadas así por las proteínas Bin, anfifisina y Rvs), y la inserción del dominio de las hélices anfipáticas en la membrana¹ . Curiosamente, estas proteínas y lípidos no solo deforman la membrana, sino que también pueden sentir la curvatura de la membrana y exhibir acumulación preferencial¹. Por lo tanto, es crucial estudiar si y cómo las membranas con diferentes curvaturas alteran la distribución y la dinámica de las proteínas y lípidos unidos a ellas y los posibles impactos en los procesos intracelulares relacionados.

Se han desarrollado muchas técnicas para analizar la interacción entre la membrana curva y las proteínas tanto en células vivas como en sistemas in vitro. El sistema de células vivas proporciona un entorno celular real con rica diversidad lipídica y regulación dinámica de señalización proteica 2,3,4,5,6,7. Sin embargo, un sistema tan sofisticado es difícil de estudiar debido a las incertidumbres y fluctuaciones en el entorno intracelular. Por lo tanto, los ensayos in vitro utilizando una membrana artificial compuesta de especies lipídicas conocidas y proteínas purificadas se han convertido en poderosos sistemas de reconstitución para caracterizar la relación entre proteínas y membranas curvas. Tradicionalmente, los liposomas de diferentes diámetros se generan por extrusión para detectar proteínas sensibles a la curvatura mediante un ensayo de cosedimentación utilizando fuerza centrífuga o un ensayo de coflotación con un gradiente de densidad para evitar la agregación de proteínas ^8,9. Sin embargo, la curvatura de los liposomas extruidos está limitada por el tamaño de poro disponible del filtro de membrana utilizado en la extrusora¹⁰. Se ha demostrado que el ensayo de curvatura de liposoma único (SLiC) supera esta limitación, en el que los liposomas con diferentes diámetros son marcados con fluorescencia e inmovilizados sobre la superficie para que la curvatura pueda ser marcada por la intensidad fluorescente¹¹. Sin embargo, se ha observado una fuerte variabilidad en la composición lipídica en vesículas pequeñas, lo que afecta la precisión de la medición de la curvatura¹². Los experimentos de tracción de la correa proporcionan una medición más precisa de la curvatura en la correa transitoria extraída de vesículas unilamelares gigantes (GUV) utilizando una pinza óptica, donde la curvatura puede ser bien controlada por la tensión de membrana generada^13,14. Este método es adecuado para estudiar proteínas de detección de curvatura positiva o negativa, pero está limitado por el rendimiento de la generación de tubos¹⁰. El ensayo de tubos de membrana soportados (SMrT) permite la generación simultánea de múltiples tubos de membrana que se extruyen del mismo depósito de lípidos mediante flujos microfluídicos. Sin embargo, la curvatura de la membrana varía intrínsecamente a lo largo del nanotubo, lo que compromete la precisión de la medición de la curvatura basada en la intensidad de fluorescencia^15,16. En comparación, el uso de pequeñas vesículas unilamelares (SUVs, diámetro <100 nm¹⁷) para formar una bicapa lipídica soportada (SLB) en superficies que contienen topografías diseñadas generó una sola membrana bicapa con curvaturas predeterminadas por nanofabricación o nanomateriales en alta precisión^18,19,20.

Aquí, presentamos un protocolo para la formación del SLB en superficies de nanochips fabricadas con matrices de nanobarras y cómo se puede usar para probar la sensibilidad a la curvatura de proteínas in vitro. Como se muestra en la Figura 1, hay seis componentes esenciales del ensayo: A) Limpieza y montaje del chip con una cámara microfluídica; B) Preparación de SUV con composición lipídica definida; C) Formación del SLB en un nanochip y unión con proteínas sensibles a la curvatura; D) Obtención de imágenes y caracterización de las proteínas sensibles a SLB y curvatura bajo microscopía de fluorescencia; E) Limpieza del chip para su reutilización; F) Procesamiento de imágenes para el análisis cuantitativo de la capacidad de detección de curvatura de proteínas. El protocolo detallado se describe paso a paso a continuación.