Липидная двухслойная система с поддержкой нанобара для изучения белков, чувствительных к кривизне мембраны in vitro

Кривизна мембраны является критическим физическим параметром клетки, который происходит в различных клеточных процессах, таких как морфогенез, деление клеток и миграция клеток¹. В настоящее время широко признано, что кривизна мембраны выходит за рамки простого результата клеточных событий; вместо этого он стал эффективным регулятором белковых взаимодействий и внутриклеточной сигнализации. Например, было обнаружено, что несколько белков, участвующих в клатрин-опосредованном эндоцитозе, предпочтительно связываются с изогнутой мембраной, что приводит к образованию горячей точки для эндоцитоза². Существует много различных причин деформации мембраны, таких как притяжение мембраны цитоскелетными силами, наличие асимметрии липидов с различными по размеру головными группами, существование трансмембранных белков с конической формой, накопление мембранообразующих белков, таких как белки BAR-домена (названные в честь белков Bin, amphiphysin и Rvs), и вставка домена амфипатических спиралей в мембрану¹ . Интересно, что эти белки и липиды не только деформируют мембрану, но также могут ощущать искривление мембраны и проявлять предпочтительное накопление¹. Поэтому крайне важно изучить, изменяют ли мембраны с различными кривизнами распределение и динамику белков и липидов, прикрепленных к ним, и потенциальное воздействие на связанные внутриклеточные процессы.

Многие методы были разработаны для анализа взаимодействия между изогнутой мембраной и белками как в живых клетках, так и в системах in vitro. Система живых клеток обеспечивает реальную клеточную среду с богатым липидным разнообразием и динамической регуляцией передачи сигналов белка 2,3,4,5,6,7. Однако такую сложную систему трудно изучать из-за неопределенностей и флуктуаций во внутриклеточной среде. Следовательно, анализы in vitro с использованием искусственной мембраны, состоящей из известных видов липидов и очищенных белков, стали мощными системами восстановления для характеристики отношений между белками и изогнутыми мембранами. Традиционно липосомы различного диаметра генерируются экструзией для обнаружения чувствительных к кривизне белков либо с помощью анализа совместного осаждения с использованием центробежной силы, либо анализа совместной флотации с градиентом плотности, чтобы избежать агрегации белка ^8,9. Однако кривизна экструдированных липосом ограничена доступным размером пор мембранного фильтра, используемого в экструдере¹⁰. Было доказано, что анализ искривления одной липосомы (SLiC) преодолевает это ограничение, в котором липосомы с различным диаметром мечутся флуоресценцией и иммобилизуются на поверхность, так что кривизна может быть отмечена флуоресцентной интенсивностью¹¹. Однако сильная изменчивость липидного состава наблюдалась в небольших везикулах, что влияет на точность измерения кривизны¹². Эксперименты по вытягиванию троса обеспечивают более точное измерение кривизны на переходном тросе, вытягиваемом из гигантских одноламеллярных везикул (GUV) с использованием оптического пинцета, где кривизна может хорошо контролироваться напряжением мембраны, генерируемым^13,14. Этот метод подходит для изучения белков, чувствительных к положительной или отрицательной кривизне, но ограничен пропускной способностью трубчатой генерации¹⁰. Анализ поддерживаемых мембранных трубок (SMrT) обеспечивает одновременную генерацию нескольких мембранных трубок, которые выдавливаются из одного и того же липидного резервуара микрофлюидными потоками. Тем не менее, кривизна мембраны изменяется внутренне вдоль нанотрубки, что ставит под угрозу точность измерения кривизны на основе интенсивности флуоресценции^15,16. Для сравнения, использование небольших одноламеллярных везикул (внедорожников, диаметром <100 нм¹⁷) для формирования поддерживаемого липидного бислоя (SLB) на поверхностях, содержащих разработанные топографии, генерировало одну двухслойную мембрану с кривизнами, предопределенными нанопроизводством или наноматериалами с высокой точностью 18,19,20.

Здесь мы представляем протокол формирования SLB на изготовленных поверхностях наночипов с нанобарными массивами и то, как его можно использовать для исследования чувствительности к кривизне белков in vitro. Как показано на рисунке 1, существует шесть основных компонентов анализа: А) Очистка и сборка чипа с микрофлюидной камерой; Б) Подготовка внедорожников с определенным липидным составом; В) Образование SLB на наночипе и связывание с кривизной чувствительных белков; D) Визуализация и характеристика чувствительных к SLB и кривизне белков при флуоресцентной микроскопии; Д) Очистка чипа для повторного использования; F) Обработка изображений для количественного анализа способности восприятия кривизны белка. Подробный протокол описан шаг за шагом ниже.