Um Sistema de Bicamada Lipídica Suportado por Nanobar para o Estudo de Proteínas de Detecção de Curvatura de Membrana in vitro

A curvatura da membrana é um parâmetro físico crítico de uma célula que ocorre em uma variedade de processos celulares, como morfogênese, divisão celular e migração celular¹. É amplamente reconhecido agora que a curvatura da membrana está além de um simples resultado de eventos celulares; em vez disso, emergiu como um regulador eficaz das interações proteicas e da sinalização intracelular. Por exemplo, várias proteínas envolvidas na endocitose mediada por clatrina se ligam preferencialmente à membrana curva, resultando na formação de um hotspot para endocitose². Existem muitas causas diferentes de deformação da membrana, como a tração da membrana pelas forças do citoesqueleto, a presença de assimetria lipídica com grupos de cabeça de diferentes tamanhos, a existência de proteínas transmembranares com forma cônica, o acúmulo de proteínas modeladoras de membrana, como proteínas do domínio BAR (nomeadas após as proteínas Bin, anfifisina e Rvs) e a inserção do domínio das hélices anfipáticas na membrana¹ . Curiosamente, essas proteínas e lipídios não apenas deformam a membrana, mas também podem sentir a curvatura da membrana e exibir acúmulo preferencial¹. Portanto, é crucial estudar se e como membranas com diferentes curvaturas alteram a distribuição e a dinâmica de proteínas e lipídios ligados a elas e os impactos potenciais nos processos intracelulares relacionados.

Muitas técnicas foram desenvolvidas para analisar a interação entre membrana curva e proteínas em sistemas celulares vivos e in vitro. O sistema celular vivo proporciona um ambiente celular real com rica diversidade lipídica e regulação dinâmica da sinalização proteica 2,3,4,5,6,7. No entanto, um sistema tão sofisticado é difícil de estudar devido às incertezas e flutuações no ambiente intracelular. Assim, os ensaios in vitro utilizando uma membrana artificial composta por espécies lipídicas conhecidas e proteínas purificadas tornaram-se poderosos sistemas de reconstituição para caracterizar a relação entre proteínas e membranas curvas. Tradicionalmente, lipossomas de diferentes diâmetros são gerados por extrusão para detectar proteínas sensíveis à curvatura por meio de um ensaio de co-sedimentação usando força centrífuga ou um ensaio de co-flotação com um gradiente de densidade para evitar a agregação de proteínas ^8,9. No entanto, a curvatura dos lipossomas extrudados é limitada pelo tamanho dos poros disponíveis do filtro de membrana utilizado na extrusora¹⁰. Está comprovado que o ensaio de curvatura de lipossomo único (SLiC) supera essa limitação, no qual lipossomas com diferentes diâmetros são marcados com fluorescência e imobilizados na superfície para que a curvatura possa ser marcada pela intensidade fluorescente¹¹. Entretanto, tem sido observada forte variabilidade na composição lipídica em pequenas vesículas, o que afeta a acurácia da medida da curvatura¹². Experimentos de puxar amarração fornecem uma medida mais precisa da curvatura na corda transitória puxada de vesículas unilamelares gigantes (GUVs) usando um tweezer óptico, onde a curvatura pode ser bem controlada pela tensão da membrana gerada^13,14. Este método é adequado para estudar proteínas de detecção de curvatura positiva ou negativa, mas é limitado pelo rendimento da geração de tubos¹⁰. O ensaio de tubos de membrana suportados (SMrT) permite a geração simultânea de múltiplos tubos de membrana que são extrudados do mesmo reservatório lipídico por fluxos microfluídicos. No entanto, a curvatura da membrana varia intrinsecamente ao longo do nanotubo, o que compromete a precisão da medida da curvatura baseada na intensidade de fluorescência^15,16. Em comparação, a utilização de pequenas vesículas unilamelares (SUVs, diâmetro <100 nm¹⁷) para formar uma bicamada lipídica suportada (SLB) em superfícies contendo topografias projetadas gerou uma única membrana bicamada com curvaturas predeterminadas por nanofabricação ou nanomateriais em alta precisão^18,19,20.

Aqui, apresentamos um protocolo para a formação do SLB em superfícies de nanochips fabricadas com matrizes de nanobarras e como ele pode ser usado para sondar a sensibilidade à curvatura de proteínas in vitro. Como mostra a Figura 1, existem seis componentes essenciais do ensaio: A) Limpeza e montagem do chip com câmara microfluídica; B) Preparação de SUVs com composição lipídica definida; C) Formação do SLB em nanochip e ligação com proteínas sensíveis à curvatura; D) Imagem e caracterização do SLB e proteínas sensíveis à curvatura sob microscopia de fluorescência; E) Limpeza do chip para reutilização; F) Processamento de imagens para análise quantitativa da capacidade de detecção da curvatura de proteínas. O protocolo detalhado é descrito passo a passo abaixo.