in vitroでの膜曲率感知タンパク質の研究のためのナノバー支持脂質二重層システム

膜湾曲は、形態形成、細胞分裂、細胞移動などのさまざまな細胞プロセスで発生する細胞の重要な物理的パラメータです¹。膜の湾曲は細胞イベントの単純な結果を超えていることが現在広く認識されています。代わりに、タンパク質相互作用と細胞内シグナル伝達の効果的な調節因子として浮上しています。例えば、クラスリン媒介性エンドサイトーシスに関与するいくつかのタンパク質は、湾曲した膜に優先的に結合し、エンドサイトーシスのホットスポットを形成することが見出された²。膜変形の原因は、細胞骨格力による膜の引っ張り、異なるサイズの頭部基を持つ脂質非対称性の存在、円錐形の膜貫通タンパク質の存在、BARドメインタンパク質(Bin、アンフィフィシン、Rvsタンパク質にちなんで名付けられた)などの膜形成タンパク質の蓄積、および両親媒性ヘリックスドメインの膜への挿入など、さまざまな原因があります¹.興味深いことに、これらのタンパク質と脂質は膜を変形させるだけでなく、膜の湾曲を感知し、優先的な蓄積を示すことができます¹。したがって、曲率の異なる膜が、それらに付着したタンパク質や脂質の分布や動態、および関連する細胞内プロセスへの潜在的な影響を変化させるかどうか、またどのように変化するかを研究することが重要です。

生細胞系とin vitro系の両方における湾曲膜とタンパク質の相互作用を分析するために、多くの技術が開発されてきました。生細胞システムは、豊富な脂質多様性と動的なタンパク質シグナル伝達調節を備えた実際の細胞環境を提供します2,3,4,5,6,7。しかし、このような洗練されたシステムは、細胞内環境の不確実性と変動のために研究が困難です。したがって、既知の脂質種と精製タンパク質で構成される人工膜を使用したin vitroアッセイは、タンパク質と湾曲した膜との関係を特徴付けるための強力な再構成システムになっています。伝統的に、異なる直径のリポソームは、遠心力を用いた共沈降アッセイまたはタンパク質凝集を回避するための密度勾配を有する共浮遊アッセイのいずれかを介して曲率感受性タンパク質を検出するために押出成形によって生成される^8,9。しかしながら、押出リポソームの曲率は、押出機¹⁰で使用されるメンブレンフィルターの利用可能な孔径によって制限される。単一リポソーム曲率(SLiC)アッセイは、異なる直径を有するリポソームが蛍光標識され、表面に固定化され、曲率を蛍光強度によってマークすることができるというこの制限を克服することが証明されている¹¹。しかしながら、脂質組成の強い変動は、小さな小胞において観察されており、これは曲率測定の精度に影響を及ぼす¹²。テザー引っ張り実験は、光ピンセットを使用して巨大な単層小胞(GUV)から引き出された過渡テザーの曲率のより正確な測定を提供し、曲率は生成された膜張力によって十分に制御することができる^13,14。この方法は、正または負の曲率感知タンパク質の研究に適していますが、チューブジェネレーション¹⁰のスループットによって制約されます。サポートされているメンブレンチューブ(SMrT)アッセイは、マイクロ流体の流れによって同じ脂質リザーバーから押し出される複数のメンブレンチューブの同時生成を可能にします。それにもかかわらず、膜の曲率はナノチューブに沿って本質的に変化し、蛍光強度に基づく曲率測定の精度を損なう^15,16。比較すると、小さな単層小胞(SUV、直径<100nm17)を使用して、設計されたトポグラフィーを含む表面に支持された脂質二重層(SLB)を形成し、ナノ加工またはナノ材料によって所定の曲率を有する単一の二層膜を高精度で生成した^18、19、20。

ここでは、ナノバーアレイを用いて作製したナノチップ表面上にSLBを形成するためのプロトコルと、それを使用してin vitroでタンパク質の曲率感度を調べる方法を紹介します。 図1に示すように、アッセイには6つの必須コンポーネントがあります:A)マイクロ流体チャンバーによるチップの洗浄と組み立て。B)定義された脂質組成を有するSUVの調製;C)ナノチップ上でのSLBの形成および湾曲感受性タンパク質との結合;D)蛍光顕微鏡下でのSLBおよび曲率感受性タンパク質のイメージングおよび特性評価。E)再利用のためにチップをクリーニングする。F)タンパク質曲率感知能の定量的解析のための画像処理。詳細なプロトコルについては、以下で段階的に説明します。