Ein Nanobar-gestütztes Lipiddoppelschichtsystem zur Untersuchung von Membrankrümmungssensorproteinen in vitro

Die Membrankrümmung ist ein kritischer physikalischer Parameter einer Zelle, der bei einer Vielzahl von zellulären Prozessen wie Morphogenese, Zellteilung und Zellmigration auftritt¹. Es ist heute allgemein anerkannt, dass die Membrankrümmung über ein einfaches Ergebnis zellulärer Ereignisse hinausgeht; Stattdessen hat es sich als wirksamer Regulator von Proteininteraktionen und intrazellulären Signalen herausgestellt. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass mehrere Proteine, die an der Clathrin-vermittelten Endozytose beteiligt sind, bevorzugt an die gekrümmte Membran binden, was zur Bildung eines Hotspots für Endozytose² führt. Es gibt viele verschiedene Ursachen für die Membranverformung wie das Ziehen der Membran durch die Zytoskelettkräfte, das Vorhandensein von Lipidasymmetrie mit unterschiedlich großen Kopfgruppen, das Vorhandensein von Transmembranproteinen mit konischer Form, die Akkumulation von membranformenden Proteinen wie BAR-Domänenproteinen (benannt nach Bin-, Amphiphysin- und Rvs-Proteinen) und das Einfügen amphipathischer Helices-Domäne in die Membran¹ . Interessanterweise verformen diese Proteine und Lipide nicht nur die Membran, sondern können auch die Membrankrümmung wahrnehmen und eine bevorzugte Akkumulation aufweisen¹. Daher ist es entscheidend zu untersuchen, ob und wie Membranen mit unterschiedlichen Krümmungen die Verteilung und Dynamik der an sie gebundenen Proteine und Lipide verändern und welche Auswirkungen dies auf die damit verbundenen intrazellulären Prozesse haben kann.

Viele Techniken wurden entwickelt, um die Interaktion zwischen gekrümmter Membran und Proteinen sowohl in lebenden Zell- als auch in In-vitro-Systemen zu analysieren. Das Lebendzellsystem bietet eine reale Zellumgebung mit reicher Lipiddiversität und dynamischer Proteinsignalregulation 2,3,4,5,6,7. Ein solch ausgeklügeltes System ist jedoch aufgrund der Unsicherheiten und Schwankungen in der intrazellulären Umgebung schwer zu untersuchen. Daher sind die In-vitro-Assays mit einer künstlichen Membran, die aus bekannten Lipidspezies und gereinigten Proteinen besteht, zu leistungsfähigen Rekonstitutionssystemen geworden, um die Beziehung zwischen Proteinen und gekrümmten Membranen zu charakterisieren. Herkömmlicherweise werden Liposomen unterschiedlicher Durchmesser durch Extrusion erzeugt, um krümmungsempfindliche Proteine entweder über einen Co-Sedimentationsassay mit Zentrifugalkraft oder einen Coflotationsassay mit einem Dichtegradienten zu detektieren, um eine Proteinaggregation zu vermeiden ^8,9. Die Krümmung der extrudierten Liposomen ist jedoch durch die verfügbare Porengröße des im Extruder¹⁰ verwendeten Membranfilters begrenzt. Es wurde nachgewiesen, dass der Single Liposome Curvature (SLiC) Assay diese Einschränkung überwindet, bei der Liposomen mit unterschiedlichen Durchmessern fluoreszenzmarkiert und auf der Oberfläche immobilisiert werden, so dass die Krümmung durch die Fluoreszenzintensität markiert werden kann¹¹. Es wurde jedoch eine starke Variabilität der Lipidzusammensetzung in kleinen Vesikeln beobachtet, was die Genauigkeit der Krümmungsmessung beeinflusst¹². Tether-Pulling-Experimente liefern eine genauere Messung der Krümmung des transienten Seils, das von riesigen unilamellären Vesikeln (GUVs) gezogen wird, mit einer optischen Pinzette, bei der die Krümmung durch die erzeugte Membranspannung gut gesteuert werden kann^13,14. Diese Methode eignet sich zur Untersuchung von Proteinen mit positiver oder negativer Krümmung, ist jedoch durch den Durchsatz der Röhrchenerzeugung¹⁰ eingeschränkt. Der SMrT-Assay (Supported Membrane Tubes) ermöglicht die gleichzeitige Erzeugung mehrerer Membranröhren, die durch mikrofluidische Strömungen aus demselben Lipidreservoir extrudiert werden. Dennoch variiert die Membrankrümmung intrinsisch entlang der Nanoröhre, was die Genauigkeit der fluoreszenzintensitätsbasierten Krümmungsmessung^{beeinträchtigt 15,16}. Im Vergleich dazu erzeugte die Verwendung kleiner unilamellärer Vesikel (SUVs, Durchmesser <100 nm¹⁷) zur Bildung einer unterstützten Lipiddoppelschicht (SLB) auf Oberflächen, die entworfene Topographien enthielten, eine einzelne Doppelschichtmembran mit Krümmungen, die durch Nanofabrikation oder Nanomaterialien in hoher Genauigkeit vorbestimmt^{waren 18,19,20}.

Hier stellen wir ein Protokoll für die Bildung des SLB auf hergestellten Nanochip-Oberflächen mit Nanobar-Arrays vor und wie damit die Krümmungsempfindlichkeit von Proteinen in vitro untersucht werden kann. Wie in Abbildung 1 gezeigt, gibt es sechs wesentliche Komponenten des Assays: A) Reinigung und Montage des Chips mit einer mikrofluidischen Kammer; B) Herstellung von SUVs mit definierter Lipidzusammensetzung; C) Bildung des SLB auf einem Nanochip und Bindung an krümmungsempfindliche Proteine; D) Bildgebung und Charakterisierung der SLB- und krümmungsempfindlichen Proteine mittels Fluoreszenzmikroskopie; E) Reinigung des Chips zur Wiederverwendung; F) Bildverarbeitung zur quantitativen Analyse der Proteinkrümmungsfähigkeit. Das detaillierte Protokoll wird im Folgenden Schritt für Schritt beschrieben.