Système bicouche lipidique supporté par nanobar pour l’étude in vitro de protéines de détection de courbure membranaire

La courbure membranaire est un paramètre physique critique d’une cellule qui se produit dans une variété de processus cellulaires tels que la morphogenèse, la division cellulaire et la migration cellulaire¹. Il est maintenant largement reconnu que la courbure de la membrane est au-delà d’un simple résultat d’événements cellulaires; Au lieu de cela, il est apparu comme un régulateur efficace des interactions protéiques et de la signalisation intracellulaire. Par exemple, plusieurs protéines impliquées dans l’endocytose médiée par la clathrine se lient préférentiellement à la membrane incurvée, entraînant la formation d’un point chaud pour l’endocytose². Il existe de nombreuses causes différentes de déformation membranaire telles que l’attraction de la membrane par les forces du cytosquelette, la présence d’asymétrie lipidique avec des groupes de tête de différentes tailles, l’existence de protéines transmembranaires de forme conique, l’accumulation de protéines de formation de la membrane comme les protéines du domaine BAR (nommées d’après les protéines Bin, amphiphysine et Rvs), et l’insertion du domaine des hélices amphipathiques dans la membrane¹ . Fait intéressant, ces protéines et lipides non seulement déforment la membrane, mais peuvent également détecter la courbure de la membrane et présenter une accumulation préférentielle¹. Par conséquent, il est crucial d’étudier si et comment des membranes avec des courbures différentes modifient la distribution et la dynamique des protéines et des lipides qui leur sont attachés et les impacts potentiels sur les processus intracellulaires connexes.

De nombreuses techniques ont été développées pour analyser l’interaction entre la membrane incurvée et les protéines dans les cellules vivantes et les systèmes in vitro. Le système cellulaire vivant fournit un environnement cellulaire réel avec une riche diversité lipidique et une régulation dynamique de la signalisation des protéines 2,3,4,5,6,7. Cependant, un système aussi sophistiqué est difficile à étudier en raison des incertitudes et des fluctuations de l’environnement intracellulaire. Par conséquent, les essais in vitro utilisant une membrane artificielle composée d’espèces lipidiques connues et de protéines purifiées sont devenus de puissants systèmes de reconstitution pour caractériser la relation entre les protéines et les membranes courbes. Traditionnellement, des liposomes de différents diamètres sont générés par extrusion pour détecter les protéines sensibles à la courbure via soit un test de co-sédimentation utilisant la force centrifuge, soit un test de co-flottation avec un gradient de densité pour éviter l’agrégation des protéines ^8,9. Cependant, la courbure des liposomes extrudés est limitée par la taille des pores disponibles du filtre à membrane utilisé dans l’extrudeuse¹⁰. Il a été prouvé que le test de courbure mono-liposomique (SLiC) surmonte cette limitation, dans lequel des liposomes de différents diamètres sont marqués par fluorescence et immobilisés sur la surface afin que la courbure puisse être marquée par l’intensité fluorescente¹¹. Cependant, une forte variabilité de la composition lipidique a été observée dans les petites vésicules, ce qui affecte la précision de la mesure de la courbure¹². Les expériences de traction d’attache fournissent une mesure plus précise de la courbure sur l’attache transitoire tirée des vésicules unilamellaires géantes (GUV) à l’aide d’une pince optique, où la courbure peut être bien contrôlée par la tension membranaire générée^13,14. Cette méthode convient à l’étude des protéines de détection de courbure positive ou négative, mais elle est limitée par le débit de la génération de tubes¹⁰. Le test des tubes à membrane supportée (SMrT) permet la génération simultanée de plusieurs tubes à membrane qui sont extrudés à partir du même réservoir lipidique par des écoulements microfluidiques. Néanmoins, la courbure de la membrane varie intrinsèquement le long du nanotube, ce qui compromet la précision de la mesure de la courbure basée sur l’intensité de fluorescence^15,16. En comparaison, l’utilisation de petites vésicules unilamellaires (VUS, diamètre <100 nm¹⁷) pour former une bicouche lipidique supportée (SLB) sur des surfaces contenant des topographies conçues a généré une membrane bicouche unique avec des courbures prédéterminées par nanofabrication ou nanomatériaux de haute précision^18,19,20.

Ici, nous présentons un protocole pour la formation du SLB sur des surfaces de nanopuces fabriquées avec des réseaux nanobar et comment il peut être utilisé pour sonder la sensibilité à la courbure des protéines in vitro. Comme le montre la figure 1, le test comporte six composants essentiels : A) Nettoyage et assemblage de la puce avec une chambre microfluidique; B) Préparation de VUS avec une composition lipidique définie; C) Formation du SLB sur une nanopuce et liaison avec des protéines sensibles à la courbure; D) Imagerie et caractérisation des protéines sensibles au SLB et à la courbure sous microscopie à fluorescence; E) Nettoyage de la puce pour la réutiliser; F) Traitement d’images pour l’analyse quantitative de la capacité de détection de la courbure des protéines. Le protocole détaillé est décrit étape par étape ci-dessous.