JoVE Journal > Biochemistry
Özet
Abstract
Introduction
Protocol
Sonuçlar
Discussion
Açıklamalar
Acknowledgements
Materials
Referanslar
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biyokimya

Een nanobar-ondersteund lipide bilayer-systeem voor de studie van membraankrommingsgevoelige eiwitten in vitro

Published: November 30, 2022
doi:
10.3791/64340
, ,
1School of Chemistry, Chemical Engineering, and Biotechnology,Nanyang Technological University, 2State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry Synthesis Technology, College of Chemical Engineering,Zhejiang University of Technology, 3Institute for Digital Molecular Analytics and Science,Nanyang Technological University

Özet

Hier wordt een nanobar-ondersteund lipide bilayer-systeem ontwikkeld om een synthetisch membraan te bieden met een gedefinieerde kromming die de karakterisering van eiwitten met krommingsdetectievermogen in vitro mogelijk maakt.

Abstract

Membraankromming speelt een belangrijke rol in verschillende essentiële processen van cellen, zoals celmigratie, celdeling en vesikelhandel. Het wordt niet alleen passief gegenereerd door cellulaire activiteiten, maar reguleert ook actief eiwitinteracties en is betrokken bij veel intracellulaire signalering. Het is dus van grote waarde om de rol van membraankromming bij het reguleren van de distributie en dynamiek van eiwitten en lipiden te onderzoeken. Onlangs zijn er veel technieken ontwikkeld om de relatie tussen het gebogen membraan en eiwit in vitro te bestuderen. In vergelijking met traditionele technieken biedt de nieuw ontwikkelde nanobar-supported lipid bilayer (SLB) zowel een hoge doorvoer als een betere nauwkeurigheid bij het genereren van membraankrommingen door een continue lipide bilayer te vormen op patroonarrays van nanobaren met een vooraf gedefinieerde membraankromming en lokale vlakke controle. Zowel de lipidefluïditeit als de eiwitgevoeligheid voor gebogen membranen kunnen kwantitatief worden gekarakteriseerd met behulp van fluorescentiemicroscopiebeeldvorming. Hier wordt een gedetailleerde procedure geïntroduceerd voor het vormen van een SLB op gefabriceerde glazen oppervlakken met nanobar arrays en de karakterisering van krommingsgevoelige eiwitten op dergelijke SLB. Daarnaast komen protocollen voor hergebruik van nanochips en beeldverwerking aan bod. Naast de nanobar-SLB is dit protocol gemakkelijk toepasbaar op alle soorten nanogestructureerde glaschips voor krommingsdetectiestudies.

Introduction

Membraankromming is een kritische fysieke parameter van een cel die voorkomt in een verscheidenheid aan cellulaire processen zoals morfogenese, celdeling en celmigratie1. Het wordt nu algemeen erkend dat membraankromming verder gaat dan een eenvoudig resultaat van cellulaire gebeurtenissen; in plaats daarvan is het naar voren gekomen als een effectieve regulator van eiwitinteracties en intracellulaire signalering. Verschillende eiwitten die betrokken zijn bij clathrin-gemedieerde endocytose bleken bijvoorbeeld bij voorkeur te binden aan het gebogen membraan, wat resulteerde in de vorming van een hotspot voor endocytose2. Er zijn veel verschillende oorzaken van membraanvervorming, zoals membraantrekking door de cytoskeletale krachten, de aanwezigheid van lipide-asymmetrie met hoofdgroepen van verschillende grootte, het bestaan van transmembraaneiwitten met conische vorm, de accumulatie van membraanvormende eiwitten zoals BAR-domeineiwitten (genoemd naar Bin-, amfifysine- en Rvs-eiwitten) en het inbrengen van amfipathische helicesdomein in het membraan1 . Interessant is dat deze eiwitten en lipiden niet alleen het membraan vervormen, maar ook de membraankromming kunnen voelen en preferentiële accumulatie vertonen1. Daarom is het cruciaal om te bestuderen of en hoe membranen met verschillende krommingen de distributie en dynamiek van eiwitten en lipiden die eraan vastzitten en de mogelijke effecten op de gerelateerde intracellulaire processen veranderen.

Er zijn veel technieken ontwikkeld om de interactie tussen gebogen membraan en eiwitten in zowel levende cel- als in vitrosystemen te analyseren. Het levende celsysteem biedt een echte celomgeving met een rijke lipidendiversiteit en dynamische eiwitsignaleringsregulatie 2,3,4,5,6,7. Een dergelijk geavanceerd systeem is echter moeilijk te bestuderen vanwege de onzekerheden en fluctuaties in de intracellulaire omgeving. Vandaar dat de in vitro assays met behulp van een kunstmatig membraan dat bestaat uit bekende lipidesoorten en gezuiverde eiwitten krachtige reconstitutiesystemen zijn geworden om de relatie tussen eiwitten en gebogen membranen te karakteriseren. Traditioneel worden liposomen van verschillende diameters gegenereerd door extrusie om krommingsgevoelige eiwitten te detecteren via een co-sedimentatietest met centrifugale kracht of een co-flotatietest met een dichtheidsgradiënt om eiwitaggregatie te voorkomen 8,9. De kromming van de geëxtrudeerde liposomen wordt echter beperkt door de beschikbare poriegrootte van het membraanfilter dat in de extruderwordt gebruikt 10. Het is bewezen dat single liposome curvature (SLiC) assay deze beperking overwint, waarbij liposomen met verschillende diameters fluorescentie-gelabeld en geïmmobiliseerd op het oppervlak worden geïmmobiliseerd, zodat de kromming kan worden gemarkeerd door de fluorescerende intensiteit11. Er is echter een sterke variabiliteit in lipidesamenstelling waargenomen bij kleine blaasjes, wat de nauwkeurigheid van de krommingsmeting beïnvloedt12. Tether-pulling experimenten bieden een nauwkeurigere meting van de kromming op de transiënte tether getrokken uit gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs) met behulp van een optisch pincet, waarbij de kromming goed kan worden geregeld door degegenereerde membraanspanning 13,14. Deze methode is geschikt om positieve of negatieve krommingsgevoelige eiwitten te bestuderen, maar wordt beperkt door de doorvoer van buisgeneratie10. Ondersteunde membraanbuizen (SMrT) assay biedt gelijktijdige generatie van meerdere membraanbuizen die door microfluïdische stromen uit hetzelfde lipidereservoir worden geëxtrudeerd. Niettemin varieert de membraankromming intrinsiek langs de nanobuis, wat de nauwkeurigheid van op fluorescentie-intensiteit gebaseerde krommingsmeting15,16 in gevaar brengt. Ter vergelijking: het gebruik van kleine unilamellaire blaasjes (SUV’s, diameter <100 nm17) om een ondersteunde lipide bilayer (SLB) te vormen op oppervlakken met ontworpen topografieën genereerde een enkel dubbellaags membraan met krommingen vooraf bepaald door nanofabricage of nanomaterialen met hoge nauwkeurigheid 18,19,20.

Hier presenteren we een protocol voor de vorming van de SLB op gefabriceerde nanochipoppervlakken met nanobar arrays en hoe het kan worden gebruikt om de krommingsgevoeligheid van eiwitten in vitro te onderzoeken. Zoals te zien is in figuur 1, zijn er zes essentiële componenten van de test: A) Reiniging en assemblage van de chip met een microfluïdische kamer; B) Bereiding van SUV’s met een gedefinieerde lipidesamenstelling; C) Vorming van de SLB op een nanochip en binding met krommingsgevoelige eiwitten; D) Beeldvorming en karakterisering van de SLB en krommingsgevoelige eiwitten onder fluorescentiemicroscopie; E) Het reinigen van de chip voor hergebruik; F) Beeldverwerking voor kwantitatieve analyse van het detectievermogen van eiwitkrommingen. Het gedetailleerde protocol wordt hieronder stap voor stap beschreven.

Protocol

1. Reiniging van nanochips Plaats de nanochip in een bekerglas van 10 ml met de patroonzijde naar boven gericht.OPMERKING: Deze kwarts nanochip is vervaardigd via elektronenbundellithografie zoals beschreven vóór21. De geometrie en rangschikking van de nanostructuur op de chip kan op maat worden ontworpen. De maten van de gradiënt nanobars die hier worden gebruikt, zijn 2000 nm lang, 600 nm hoog en 100 tot 1000 nm breed (100 nm stappenset). Voeg…

Representative Results

Nanobar-ontwerp wordt aanbevolen voor het onderzoeken van positieve krommingsgevoelige eiwitten, die aan elk uiteinde een halve cirkel bevatten met kromming gedefinieerd door de nanobarbreedte en één vlakke / nulkrommingsregeling lokaal in het midden (figuur 2A, B). Succesvolle vorming van de SLB op nanobars resulteert in gelijkmatig verdeelde lipidemarkersignalen over het gehele nanobaroppervlak, zoals weergegeven in figuur 2C. Signalen van m…

Discussion

Het hier beschreven nanobar-SLB-systeem biedt een unieke combinatie van de voordelen in verschillende bestaande in vitro assays. Het onthult efficiënt de preferentiële binding van eiwitten aan sterk gebogen membranen als de liposoom floatatie- of sedimentatietest, maar vereist veel minder monsters en biedt nauwkeuriger gedefinieerde kromming op individuele nanobaren 8,29. Het biedt ook een breed scala aan nauwkeurig gecontroleerde krommingen voor gelij…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We bedanken Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) en het Centre for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) aan de Nanyang Technological University (NTU) voor het ondersteunen van nanostructuurfabricage en SEM-beeldvorming, het Protein Production Platform (PPP) aan de School of Biological Sciences NTU voor eiwitzuivering en de School of Chemical and Biomedical Engineering NTU voor de confocale microscoop. Dit werk wordt gefinancierd door het Ministerie van Onderwijs van Singapore (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 en MOE-T2EP30220-0009), het Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS), ondersteund door MOE-financiering in het kader van het Research Centres of Excellence-programma (W. Zhao), de Human Frontier Science Program Foundation (W. Zhao, RGY0088/2021), de NTU Start-up Grant (W. Zhao), School of Chemical and Biomedical Engineering NTU voor de onderzoeksbeurs (X. Miao) en China Scholarship Council voor de onderzoeksbeurs (J. Wu).

Materials

Anhydrous Ethanol Sigma-Aldrich 100983
Aluminum foil Diamond RN0879999FU
Amber Vial Sigma-Aldrich 27115-U
Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 840032
10 mL Beaker Schott-Duran SCOT211060804
50 mL Beaker Schott-Duran SCOT211061706
1000 mL Beaker Schott-Duran SCOT211065408 The second container 
Chloroform Sigma-Aldrich V800117
Cotton buds Watsons
18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) Avanti Polar Lipids, Inc. 790404
Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids, Inc. 840051
F-BAR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
F-BAR+IDR Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GFP-His Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore Proteins and peptide
GraphPad Prism GraphPad V9.0.0
Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) Thermo Scientific H325-500
IDR from human FBP17 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
ImageJ National Institutes of Health 1.50d
Laser Scanning Confocal Microscopy Zeiss  LSM 800 with Airyscan 100x (N.A.1.4) oil objective.
Methanol Fisher scientific 10010240
Mini-extuder  Avanti Polar Lipids, Inc. 610000-1EA
1.5 mL Microtubes Greiner 616201
MATLAB Mathworks R2018b
Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm Whatman 800309
Phosphate Bufferen Saline (PBS) Life Technologies Holdings Pte Ltd. 70013
Polydimethylsiloxane (PDMS) Base Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker Dow Corning Corporation SYLGARD 184
Plasma Cleaner HARRICK PLASMA PDC-002-HP
Quartz Nanochip Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD
Sodium Hydroxide  Sigma-Aldrich 795429
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 258105
Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt Life Technologies Holdings Pte Ltd. T1395MP
Tweezer Gooi PDC-002-HP
Ultrasonic Cleaners Elma D-78224
Voterx Scientific Industries G560E
Vacuum Desiccator NUCERITE 5312
Water Bath Julabo TW8
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referanslar

  1. McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
  2. Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
  3. Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
  4. Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).
  5. Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
  6. Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).
  7. Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).
  8. Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).
  9. Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
  10. Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).
  11. Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
  12. Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
  13. Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).
  14. Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).
  15. Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).
  16. Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).
  17. Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).
  18. Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).
  19. Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
  20. Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
  21. Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).
  22. Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).
  23. Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).
  24. Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).
  25. Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).
  26. Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).
  27. El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).
  28. Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
  29. Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).
  30. Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
  31. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  32. Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).
  33. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  34. Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).
  35. Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).
  36. Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).
  37. Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).
  38. Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).
  39. Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).
  40. Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).
  41. Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).
  42. Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).
  43. London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).
  44. Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).
  45. Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).
  46. Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).
  47. Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).

Etiketler

Nanobar-supported Lipid BilayerMembrane Curvature SensingProtein DynamicsNanofabricationPiranha SolutionLipid MixtureSUVsPDMS Chamber

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Bu Makaleden Alıntı Yapın
Miao, X., Wu, J., Zhao, W. A Nanobar-Supported Lipid Bilayer System for the Study of Membrane Curvature Sensing Proteins in vitro. J. Vis. Exp. (189), e64340, doi:10.3791/64340 (2022).
Atıfı İndir
Tekrar Baskılar ve İzinler

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image