Humane Mikroglia-ähnliche Zellen: Differenzierung aus induzierten pluripotenten Stammzellen und In-vitro-Lebendzell-Phagozytose-Assay mit humanen Synaptosomen

Mikroglia sind die residenten Immunzellen im zentralen Nervensystem (ZNS) und spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung des ZNS. Mikroglia sind auch im erwachsenen Gehirn wichtig, um die Homöostase aufrechtzuerhalten und aktiv auf Traumata und Krankheitsprozesse zu reagieren. Kumulative Evidenz zeigt, dass Mikroglia einen Schlüsselbeitrag zur Pathogenese multipler neuroentwicklungsbedingter und neurodegenerativer Erkrankungen leisten ^1,2. Obwohl das aktuelle Wissen über die Mikrogliabiologie überwiegend aus Mausmodellen abgeleitet wurde, haben neuere Studien wichtige Unterschiede zwischen murinen und menschlichen Mikroglia aufgeklärt, was die Notwendigkeit der Entwicklung von Technologien zur Untersuchung der Genetik und der biologischen Funktionen menschlicher Mikroglia unterstreicht ^3,4. Die Isolierung von Mikroglia aus seziertem Primärgewebe kann die Eigenschaften der Mikroglia stark verändern⁵, was möglicherweise die mit solchen Zellen erzielten Ergebnisse verwirrt. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, humane iPS-Zellen in iMGs zu differenzieren und dadurch ein Zellkultursystem zur Untersuchung menschlicher Mikroglia unter basalen Bedingungen bereitzustellen. Darüber hinaus ist hierin ein Phagozytose-Assay unter Verwendung eines vollständig menschlichen Modellsystems enthalten, um die Funktionalität von iMGs sowohl als Qualitätskontrollmaßnahme als auch zur Beurteilung der iMG-Dysfunktion im Kontext der Krankheit zu untersuchen.

Mehrere Protokolle zur Mikroglia-Differenzierung von iPS-Zellen sind kürzlich in der Literatur 6,7,8,9,10 aufgetaucht. Mögliche Nachteile einiger Protokolle sind verlängerte oder lange Differenzierungsperioden, die Zugabe mehrerer Wachstumsfaktoren und/oder komplexe experimentelle Verfahren ^6,9,10. Hier wird eine “benutzerfreundliche” Differenzierungsmethode demonstriert, die Aspekte der Mikroglia-Ontogenese durch Differenzierung von iPS-Zellen in Vorläuferzellen, die als primitive Makrophagen-Vorläufer (PMPs) bezeichnet werden, rekapituliert7,11. PMPs werden wie zuvor beschrieben generiert, wobei einige Optimierungen hierin¹² vorgestellt werden. Die PMPs ahmen MYB-unabhängige Dottersack-abgeleitete Makrophagen nach, die während der Embryonalentwicklung Mikroglia erzeugen, indem sie vor dem Schließen der Blut-Hirn-Schranke in das Gehirn eindringen¹³. Um PMPs in iMGs zu differenzieren, verwendeten wir eine schnelle und vereinfachte Monokulturmethode, die auf Protokollen von Haenseler et al. und Brownjohn et al. basiert, mit einigen Modifikationen, um eine effiziente Mikroglia-Differenzierungsmethode zu erzeugen, in der iMGs Mikroglia-angereicherte Marker robust exprimieren ^7,8. Diese Differenzierungsmethode kann in Laboratorien mit Expertise in der Kultur von iPSCs und mit Forschungszielen reproduziert werden, die darauf abzielen, die Mikrogliabiologie anhand eines humanen Modellsystems zu untersuchen.

iPSC-abgeleitete Mikroglia stellen eine biologisch relevante Quelle menschlicher Mikroglia für In-vitro-Experimente dar und sind ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung mikroglialer kanonischer Funktionen, einschließlich Phagozytose. Mikroglia sind die professionellen Phagozyten des Gehirns und des ZNS, wo sie Zelltrümmer, aggregierte Proteine und abgebautes Myelin¹⁴ entfernen. Mikroglia funktionieren auch beim synaptischen Umbau durch Verschlingen von Synapsen und bei der Abwehr äußerer Infektionen durch Phagozytose von Krankheitserregern^15,16. In diesem Protokoll wird die Phagozytose durch iMGs unter Verwendung menschlicher Synaptosomen als Material für das iMG-Engulfment bewertet. Zu diesem Zweck wird eine Beschreibung zur Isolierung von Synaptosomen beschrieben, die von humanenⁱ³LMNs abgeleitet sind. Die i3-LMN-abgeleiteten menschlichen Synaptosomen sind mit einem pH-sensitiven Farbstoff markiert, der die Quantifizierung von Synaptosomen ermöglicht, die während der Phagosomenverarbeitung und des Abbaus in vitro in sauren Kompartimenten lokalisiert sind. Ein Phagozytose-Assay mit Lebendzellmikroskopie wird gezeigt, um den dynamischen Prozess der Mikroglia-Verschlängung in Echtzeit zu überwachen. Dieser funktionelle Assay schafft eine Grundlage, um mögliche Defekte der Mikroglia-Phagozytose in Gesundheit und Krankheit mit einem vollständigen menschlichen System zu untersuchen.