Cellules humaines de type microglie : différenciation à partir de cellules souches pluripotentes induites et dosage in vitro de la phagocytose sur cellules vivantes à l’aide de synaptosomes humains

Les microglies sont les cellules immunitaires résidentes du système nerveux central (SNC) et jouent un rôle crucial dans le développement du SNC. Les microglies sont également importantes dans le cerveau adulte pour maintenir l’homéostasie et répondre activement aux traumatismes et aux processus pathologiques. Les preuves cumulatives montrent que les microglies sont des contributeurs clés à la pathogenèse de multiples maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives ^1,2. Bien que les connaissances actuelles sur la biologie microgliale proviennent principalement de modèles murins, des études récentes ont élucidé des différences importantes entre la microglie murine et la microglie humaine, soulignant la nécessité de développer des technologies pour étudier la génétique et les fonctions biologiques de la microglie humaine ^3,4. L’isolement de la microglie à partir de tissu primaire disséqué peut modifier gravement les propriétés de la microglie⁵, ce qui peut confondre les résultats obtenus avec de telles cellules. L’objectif global de cette méthode est de différencier les CSPi humaines en MAGi, fournissant ainsi un système de culture cellulaire pour étudier la microglie humaine dans des conditions basales. De plus, un test de phagocytose utilisant un système modèle entièrement humain est inclus ici comme moyen d’étudier la fonctionnalité des MGi, à la fois comme mesure de contrôle de la qualité et pour évaluer le dysfonctionnement de l’iMG dans le contexte de la maladie.

De multiples protocoles de différenciation de la microglie par rapport aux CSPi ont récemment émergé dans la littérature 6,7,8,9,10. Les inconvénients potentiels de certains protocoles comprennent des périodes de différenciation prolongées ou longues, l’ajout de facteurs de croissance multiples et/ou des procédures expérimentales complexes ^6,9,10. Ici, une méthode de différenciation « conviviale » est démontrée qui récapitule les aspects de l’ontogenèse de la microglie par la différenciation des CSPi en cellules précurseurs appelées précurseurs primitifs de macrophages (PMP)^7,11. Les PMP sont générés comme décrit précédemment, avec quelques optimisations présentées ici¹². Les PMP imitent les macrophages dérivés du sac vitellin indépendants du MYB, qui donnent lieu à une microglie au cours du développement embryonnaire en envahissant le cerveau avant la fermeture de la barrière hémato-encéphalique¹³. Pour différencier de manière terminale les PMP en iMG, nous avons utilisé une méthode de monoculture rapide et simplifiée basée sur les protocoles de Haenseler et al. et Brownjohn et al., avec quelques modifications pour générer une méthode efficace de différenciation de la microglie dans laquelle les iMG expriment de manière robuste les marqueurs enrichis en microglies ^7,8. Cette méthode de différenciation peut être reproduite dans des laboratoires ayant une expertise dans la culture des CSPi et ayant des objectifs de recherche visant à étudier la biologie de la microglie à l’aide d’un système modèle humain.

Les microglies dérivées des CSPi représentent une source biologiquement pertinente de microglies humaines pour l’expérimentation in vitro et constituent un outil important pour étudier les fonctions canoniques microgliales, y compris la phagocytose. Les microglies sont les phagocytes professionnels du cerveau et du SNC, où ils éliminent les débris cellulaires, les protéines agrégées et la myéline dégradée¹⁴. La microglie fonctionne également dans le remodelage synaptique en engloutissant les synapses et dans la défense contre les infections externes par phagocytose des agents pathogènes^15,16. Dans ce protocole, la phagocytose par les iMG est évaluée à l’aide de synaptosomes humains comme matériau pour l’engloutissement de l’iMG. À cette fin, une description de l’isolement des synaptosomes dérivés de LMN i³humains est décrite. Les synaptosomes humains dérivés du LMN³sont marqués avec un colorant sensible au pH qui permet de quantifier les synaptosomes localisés dans les compartiments acides pendant le traitement et la dégradation des phagosomes in vitro. Un test de phagocytose utilisant la microscopie sur cellules vivantes est montré pour surveiller le processus dynamique d’engloutissement de la microglie en temps réel. Ce test fonctionnel établit une base pour étudier les défauts possibles de la phagocytose microgliale dans la santé et la maladie en utilisant un système humain complet.